一种重组基因型I/II非洲猪瘟病毒在猪体内的致病性及其病理生物学特征

《Virulence》：Pathogenicity and pathobiological characterization of a recombinant genotype I/II African swine fever virus in pigs

本研究通过猪体实验分析重组非洲猪瘟病毒I/II型（rASFV I/II）的致病性，发现感染猪在5.5±0.7天死亡，较II型ASFV更迅速，伴随高热、血管损伤及多器官高病毒载量，提示rASFV I/II具有更高致病性，需加强监测和疫苗研发。

　　非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus, ASFV）是一种影响家猪和野猪的高传染性病原体，能够造成严重的经济损失。近年来，在亚洲地区出现了一种高致病性的重组 ASFV 变异株，该病毒结合了基因型 I 和 II 的特征（称为“rASFV I/II”）。尽管基因型 II 的 ASFV 疫苗候选品在预防 rASFV I/II 感染方面效果有限，这成为当前防控工作的关键挑战。本研究旨在通过体内病毒感染实验，探讨 rASFV I/II 在家猪中的病理生物学特征，以期为疾病控制和预防提供科学依据。

研究中，10 只健康的 7 周龄雌性家猪被接种了 rASFV I/II 株。实验过程中，每天记录临床症状、直肠温度，并采集样本，同时在死后进行尸检。所有接种的猪只均在感染后 5-7 天内死亡，平均死亡时间为 5.5 ± 0.7 天。高热（>40.5°C）的平均出现时间为 2.6 ± 0.8 天，潜伏期平均为 3.0 ± 1.1 天。病毒 DNA 在 2 天后首次在血液中被检测到，并且其基因组拷贝数持续上升。尸检结果显示，所有感染猪均表现出严重的充血性脾肿大和出血性淋巴结病。初步比较显示，在病毒感染的早期阶段，所有三只 rASFV I/II 感染的猪都出现了内皮损伤病变，而只有其中一只基因型 II 的 ASFV 感染猪显示出这一病变。病毒 DNA 在所有器官中均被检测到，特别是在肝脏、淋巴结、脾脏、肺脏和肾脏中，拷贝数较高。这些发现表明 rASFV I/II 具有独特的病理生物学特征，亟需进一步研究其对疾病控制的影响。同时，研究结果也强调了在亚洲地区加强监测、开发快速诊断方法和有效疫苗的重要性。

ASFV 是一种包膜、大型双链 DNA 病毒，属于 Asfarviridae 家族。它感染猪科动物，包括家猪、野猪、疣猪和丛林猪，以及软蜱（Ornithodoros spp.），可引起高度传染性的出血性疾病。非洲猪瘟（ASF）对全球养猪业构成了重大威胁，由于病毒在家猪中高达 90% 的死亡率，造成了巨大的经济损失。目前，已鉴定出 23 种 ASFV 基因型，主要分布在撒哈拉以南非洲。只有两种基因型在非洲以外地区被检测到，其中基因型 I 在 1957 至 1960 年间从西非引入葡萄牙，而基因型 II 则在 2007 年从东非沿海地区传播至格鲁吉亚。在亚洲，中国于 2018 年首次发现与格鲁吉亚 07 株相似的 ASFV，并迅速传播到邻近的亚洲国家。越南在 2019 年报告了 ASF 的首次爆发，发生在河内附近约 50 公里处的 Hung Yen 省。Le 等人（2019）发现，从该地区分离的病毒株属于 p72 基因型 II，与中国的 ASFV 爆发株相同。最近，亚洲多个国家，包括中国、越南和俄罗斯，均检测到 rASFV I/II 株。因此，了解这一 ASFV 变异株的病理生物学特征及其在感染猪中的相关反应，对于有效控制和预防 ASF 疫情至关重要。

在本研究中，使用了从越南海阳省一家商业农场 ASF 爆发期间收集的猪血样，于 2023 年 10 月分离出的 rASFV I/II 株。样本采集遵循越南政府机构（国家兽医研究所，NIVR）关于 ASF 监测的法律框架，因为 ASF 是需要立即政府干预的可通报疾病。由于这是官方疾病调查的一部分，无需额外的主人同意。病毒通过猪肺泡巨噬细胞（PAM 细胞）进行分离，并命名为“ASF/HD 231005”。病毒 DNA 提取使用了 Maxwell? RSC 全血 DNA 提取试剂盒（Promega, USA），按照制造商的协议进行。约 500 ng 的纯化 DNA 被破碎成 150-250 bp 的片段，用于文库制备。破碎的 DNA 文库通过与 ASFV 特异性生物素标记的捕获探针（Celemics, 韩国）杂交，然后使用链霉亲和素包被的磁珠分离目标富集片段，未结合的 DNA 通过磁性分离去除。捕获的 DNA 通过酶解 cRNA 捕获探针并进行纯化后，使用 NextSeq 550 平台（Illumina, USA）进行 2×151 bp 配对端测序。原始测序读数通过 Trimmomatic v0.39 程序进行接头和质量修剪。修剪后的数据集通过 FastQC v0.11.9 进行质量评估，以确保去除低质量碱基和测序伪影。使用 SPAdes 基因组装配程序 v4.0.0 进行修剪序列的从头装配。对于装配中的间隙或模糊碱基区域，通过使用基因特异性引物（GSPs）设计的 PCR 扩增进行补充。PCR 产物通过 Sanger 测序（Macrogen, 韩国）进行测序，并整合到装配中以关闭间隙和解决低置信度区域。最终的全基因组序列通过 BLASTn 查询 NCBI 数据库，以确定最接近的 ASFV 株。ASF/HD 231005 的全基因组序列已存入 GenBank，访问号为 PX212717（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/PX212717）。此外，该病毒株的三个主要结构基因（B646L，p72；E183L，p54；EP402R，CD2v）的完整核苷酸序列也已存入 GenBank，访问号分别为 PQ328515（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/PQ328515）、PV614732（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/PV614732）和 PV614731（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/PV614731）。

为了确定 ASF/HD 231005 株的基因型（B646L 和 E183L）和血清型（EP402R），从 GenBank 数据库中获取了 B646L、E183L 和 EP402R 基因的参考核苷酸序列。使用 Clustal Omega v1.2.4 程序进行多序列比对，使用 IQ-TREE v2.2.0 的 ModelFinder 模块确定每个基因的最佳拟合模型。使用 IQ-TREE 构建最大似然系统发育树，并通过 1000 次超快速自举重复来评估分支支持。树的可视化和注释在 R v4.3.0（R Core Team, 奥地利维也纳）中使用 ggtree 和 ggplot2 包进行。

实验共使用了 15 只健康的 7 周龄雌性家猪（Yorkshire × Landrace × Duroc），这些猪来自越南一家商业猪场的同一批群。样本量是基于我们之前对基因型 II ASFV 的研究确定的，并且仅选择雌性猪以减少性别相关的生理差异。所有小猪在进入 NIVR 的生物安全和实验室设施之前，已接种了猪圆环病毒 2 和经典猪瘟病毒的疫苗。这些猪在进入实验室前接受了对越南主要流行病的筛查，并由兽医研究人员进行了详细检查。接种前，确认所有猪对口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和 ASFV 均为阴性。猪每天喂食商业饲料两次，并提供自由饮水。生物安全设施中的室温与湿度每天进行监测和记录。

15 只猪由 NIVR 的兽医随机分为两组：rASFV I/II 感染组（rVI，n = 10）和阴性对照组（NC，n = 5）。猪的数量是基于我们之前对基因型 II ASFV 的研究确定的，以存活率作为主要结果指标进行比较。为了确保均衡分配，接种前根据可见体型进行分层。为了减少潜在的干扰因素，实验猪被安置在单独的房间中，环境条件受到控制，以防止交叉污染并确保组别特异性结果。rVI 组的猪被安置在增强的生物安全二级设施中，并通过肌肉注射接种 1 mL 的 rASFV I/II 株，剂量为 103·? 50% 血凝抑制滴度（HAD??/mL）。NC 组的 5 只猪则被接种无菌磷酸盐缓冲液（PBS），并安置在标准条件下。实验期间，两个动物饲养设施的室温范围为 25-26°C，相对湿度为 60-80%。

本次动物实验（rASFV I/II 感染）从 2024 年 6 月至 7 月进行。15 只猪于 2024 年 6 月 24 日到达 NIVR 设施，并在其中适应了 7 天。2024 年 7 月 1 日，rVI 组的猪被接种 rASFV I/II，而对照组的猪则接种 PBS。实验于 2024 年 7 月 8 日结束，当最后一只感染猪死亡时。研究的详细方案，包括研究问题、实验设计和分析计划，均在实验开始前制定。然而，由于机构指南，实验方案未在公共仓库中注册。所有实验动物和数据均被纳入分析。

实验期间，所有猪的临床症状和直肠温度均被每日记录。临床症状评分（CS）在接种后进行计算，并按照之前的研究方法采集样本 [Citation14]。简要来说，总 CS > 3 表示存在 ASFV 感染相关的临床症状。因此，潜伏期定义为从接种到猪的总 CS 首次超过 3 的天数。从所有实验猪中每日采集血液样本和三种类型的拭子样本（口腔、鼻腔和直肠），以及环境样本（包括地面、饲料和饮水中的混合粪便）。此外，使用绳索收集的群组口腔液样本在 4 天内每天采集，遵循我们之前研究的协议 [Citation14]。人道终点根据我们之前的研究确定 [Citation19]。具体而言，当猪的总 CS 达到 10 且出现严重颤抖或无法移动（即颤抖和无法行动）时，认为其达到了预定的人道终点。

尸检在死亡后立即由指定的兽医病理学家进行，该病理学家对组别分配不知情。病理学家主要记录了 11 种器官组织的宏观病变：脾脏、下颌淋巴结（SLN）、胃肝淋巴结（GLN）、肠系膜淋巴结（MLN）、扁桃体、肺脏、肝脏、肾脏、心脏、大脑和脊髓。这些组织也用于 ASFV 基因组拷贝数的定量。此外，脾脏和肝脏组织从所有猪中获取，并用 10% 中性缓冲福尔马林固定，然后嵌入石蜡。制作 5 μm 厚的切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色以评估组织病理学病变。

所有采集的样本（血液、三种拭子样本、环境样本、口腔液和 11 种器官组织）使用 WizPrep? 病毒 DNA/RNA 小量提取试剂盒（V2）（Wizbiosolutions INC., 韩国）进行病毒 DNA 提取，按照制造商的说明操作。提取的 DNA 使用 VDx ASFV qPCR 试剂盒（Median Diagnostics, 韩国）进行 ASFV DNA 的检测，方法与我们之前的研究一致 [Citation14]。病毒拷贝数通过使用 qPCR 试剂盒制造商提供的 ASFV DNA 标准品制作的标准曲线进行测定。

在本次研究中，我们进行了初步比较，评估基因型 II ASFV 与 rASFV I/II 在感染早期的组织病理学病变。实验从 2024 年 12 月至 2025 年 1 月进行。7 只健康的 7 周龄猪于 2024 年 12 月 23 日到达 NIVR 设施，并在相同的条件下适应了 7 天。这些猪被随机分为两组：rASFV I/II 感染组（n = 3）和基因型 II ASFV 感染组（n = 3）。另外，一只猪作为阴性对照组，被接种无菌 PBS。两组均在 2024 年 12 月 30 日同时接种。所有猪均按照上述方法监测临床症状和直肠温度。在 3 天后（2025 年 1 月 2 日），所有猪均被人道地安乐死，并由训练有素的兽医病理学家进行尸检。麻醉和安乐死按照美国兽医医学协会（AVMA）2020 年动物安乐死指南和机构兽医政策进行。猪在安乐死前被肌肉注射氯胺酮盐酸盐（20 mg/kg，Yuhan Ketamine 50，Yuhan Corp., 韩国）以达到镇静效果。一旦猪被充分镇静，使用穿透式安乐死装置对头部施加冲击，并立即通过切断腋动脉进行放血以确保死亡。总共采集了五种器官组织：脾脏、SLN、GLN、MLN、扁桃体、肺脏、肝脏、肾脏、心脏、大脑和脊髓。这些组织被固定在 10% 中性缓冲福尔马林中，并运送到韩国进行组织病理学处理。由于国际检疫要求，组织病理学检查从 2025 年 8 月 1 日至 8 月 16 日进行。组织经过标准组织学处理后，嵌入石蜡，切成 5 μm 厚的切片，并用 H&E 染色以评估组织病理学病变。组织病理学病变由对组别分配不知情的兽医病理学家进行评估，并按照我们之前研究的评分系统进行分级 [Citation20]，并根据感染早期阶段进行适当调整。

在本研究中，观察到 rASFV I/II 感染猪的平均潜伏期为 3.0 ± 1.1 天，而基因型 II ASFV 感染猪的潜伏期为 3.7 ± 0.5 天。所有 rVI 组的猪均在 5-7 天内死亡，平均死亡时间为 5.5 ± 0.7 天。值得注意的是，60% 的 rVI 组猪（6 只）在 5 天内死亡，而之前的研究显示，基因型 II ASFV 感染的猪在 7.0 ± 1.2 天内死亡。rASFV I/II 感染猪的高热平均出现时间为 2.6 ± 0.8 天，比基因型 II ASFV 感染猪的高热出现时间（约 3 天）更早。虽然这些数据并非来自严格的对照实验，但两组研究均在相同的实验室条件下进行，使用相同的设施、人员和诊断协议，从而减少了研究间的差异，为比较疾病进展的观察差异提供了合理的基础。缩短的潜伏期表明，rASFV I/II 株可能具有与基因型 II ASFV 不同的致病性特征。此外，超过一半的感染猪（n = 6，60%）在 5 天内死亡，而之前的研究中，仅 10% 的基因型 II ASFV 感染猪在相同时间内死亡。这些发现也暗示了 rASFV I/II 株相较于基因型 II ASFV，可能代表了更大的疾病严重性和致死率的挑战。这些结果与之前在中国的研究一致，该研究显示 rASFV I/II 株的致病性高于基因型 II ASFV。这些结果强调了加强监测、快速诊断方法和开发针对新兴 rASFV I/II 株的有效疫苗的紧迫性。

由于 rVI 组猪的临床症状和直肠温度与之前对基因型 II ASFV 感染猪的研究相似，这表明 rASFV I/II 株可能具有相似的临床表现。然而，rVI 组的猪在环境样本中显示出更快的病毒 DNA 检测速度，包括绳索收集的口腔液、地面混合粪便、水和饲料。这些发现表明，rASFV I/II 株可能需要更严格的控制措施，因为其可能更容易导致严重爆发和快速死亡。未来的研究应旨在阐明 rASFV I/II 株致病性的分子机制，这对于开发有效的控制和预防策略至关重要。

尸检结果表明，rVI 组猪的宏观病变与我们之前对基因型 II ASFV 感染猪的研究结果相似。急性 ASFV 感染在家猪中的典型特征，包括充血性脾肿大、不同淋巴结的充血性淋巴结病，以及重要器官的出血性病变，在 rASFV I/II 感染猪中均可见。然而，与我们之前研究中基因型 II ASFV 感染猪相比，rVI 组猪在肺脏和肾脏中表现出更严重的出血性病变。此外，rVI 组猪在肺脏（rASFV I/II：7.34 ± 0.44；基因型 II：5.46 ± 5.30）和肾脏（rASFV I/II：6.67 ± 0.42；基因型 II：4.80 ± 4.84）中的病毒基因组拷贝数显著高于基因型 II ASFV 感染猪。这表明 rASFV I/II 株可能在家猪体内更迅速地传播。在之前的中国研究中，发现基因型 II ASFV 感染猪在感染后期表现出更严重的肾病变，而 rASFV I/II 感染猪则在感染早期就表现出严重的肾小管退化。此外，我们的研究已经表明，ASFV 在感染后迅速在猪体内扩散，首先在脾脏中形成病毒血症，然后扩散到其他器官，如肝脏、肺脏、SLN、MLN 和肾脏。因此，rVI 组猪肾脏中较高的病毒基因组拷贝数表明，rASFV I/II 株可能比基因型 II ASFV 更容易在宿主中快速扩散。

尽管 rVI 组猪的宏观病变与我们之前对基因型 II ASFV 感染猪的研究结果相似，但仅凭尸检难以区分感染猪是否为 rASFV I/II 或基因型 II ASFV。然而，我们发现 rASFV I/II 感染猪的一个显著特征是黄疸。所有 rVI 组猪均表现出黄疸，其中 90% 的猪出现严重的黄疸。由于 rVI 组猪的肝脏在宏观上看起来完整或无明显病变，这种黄疸可能是由于 rASFV I/II 感染引起的严重且快速的红细胞破坏，这可能导致严重的出血性损伤。此外，组织病理学分析中观察到严重的脾脏充血和大量含铁血黄素的巨噬细胞，这是广泛红细胞破坏和血红蛋白分解的标志性指标。这种大量的溶血会释放大量胆红素，超出肝脏的清除能力，导致高胆红素血症和黄疸。在肝脏中，观察到严重的充血但没有肝细胞坏死，表明肝功能几乎完好。这些组织病理学发现强烈支持黄疸并非源于肝细胞功能障碍或胆汁淤积，而是由于严重充血导致的胆红素过载。值得注意的是，黄疸在基因型 II ASFV 感染中并不常见，而这些结果表明 rASFV I/II 感染可能在猪中引发严重的溶血，表现为溶血性贫血，从而导致黄疸。

在中国，基因型 II ASFV 于 2018 年首次被发现，并在两年内广泛传播。2020 年，检测到一种低致病性的基因型 II ASFV 变异株，这可能是由于高致病性病毒的自然突变所致 [Citation23]。2021 年，河南省和山东省的猪场报告了低致病性的基因型 I ASFV 株，这些株与 1960 年代和 1980 年代在葡萄牙分离的 ASFV 株相似 [Citation24]。相比之下，越南对不同 ASFV 株的监测研究较为有限 [Citation25,Citation26]。两项先前研究识别了 p72 基因型 II ASFV 的新变种。由于越南与中国地理位置接近，新的或多样化的 ASFV 株可能正在该国出现并传播。目前，越南已批准两种活疫苗，对当地流行的基因型 II ASFV 具有保护作用。这些疫苗建议用于 4 周龄以上的猪，并且单次接种即可提供对当前在越南流行的 ASFV p72 基因型 II 病毒的保护 [Citation27,Citation28]。然而，最近的研究表明，中国的活疫苗对 rASFV I/II 株和低致病性基因型 I ASFV 株的中和效果有限 [Citation12,Citation29]。因此，rASFV I/II 株的出现强调了开发或改进能够提供跨基因型保护的疫苗平台的紧迫性，特别是鉴于现有基于基因型 II ASFV 的疫苗对这些重组变异株的保护效果有限。

综上所述，本研究揭示了越南分离的 rASFV I/II 株在家猪中的致病性，表明其具有与基因型 II ASFV 不同的病理生物学特征。rASFV I/II 感染的猪表现出较短的潜伏期、较早的高热发作、更快的死亡进程以及在多种器官中较高的病毒基因组拷贝数，同时伴有更严重的出血性病变，特别是在肺脏和肾脏中。这些发现表明，rASFV I/II 株可能对养猪业构成重大威胁，并强调了加强监测、开发快速诊断方法以及研发能够针对多种 ASFV 变异株的有效疫苗的紧迫性。未来的研究需要进一步阐明 rASFV I/II 株致病性的分子机制，这对于制定有效的控制和预防策略至关重要。