综述：泛素和SUMO通路在DNA复制及复制偶联修复中的作用

《Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology》：Ubiquitin and SUMO pathways in DNA replication and replication-coupled repair

本综述系统阐述了泛素（Ubiquitin）和小泛素样修饰剂（SUMO）通路在维持基因组稳定性中的核心作用，重点聚焦于DNA复制（正常与应激状态）、复制叉停滞与重启、DNA损伤耐受（DDT）、范可尼贫血（FA）通路以及有丝分裂DNA合成（MiDAS）等关键生物学过程。文章深入比较了酵母与脊椎动物模型中的研究进展，揭示了可逆的蛋白质翻译后修饰（PTM）如何通过调控复制体（replisome）组分（如PCNA、CMG解旋酶、FANCD2-I等）的动态修饰，精密协调复制叉保护、损伤旁路与修复通路选择，为理解基因组不稳定相关疾病（如癌症、FA）的分子机制提供了重要视角。

　　

Abstract

准确高效的DNA复制是维护基因组稳定性的最重要保障。复制起始、延伸和终止的众多环节都受到蛋白质翻译后修饰的严格调控。本文总结了泛素和小泛素样修饰剂SUMO所调控通路的最新研究进展，并比较了在酵母和脊椎动物系统中获得的见解。这些可逆修饰在DNA复制和复制偶联修复过程中都扮演着关键角色。

Introduction

泛素、小泛素样修饰剂（SUMO）和SUMO靶向泛素连接酶（STUbLs）

泛素化是一种动态的蛋白质翻译后修饰（PTM），在协调细胞对复制应激和DNA损伤的反应中起着核心作用。它由E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和负责底物识别的E3泛素连接酶催化完成，其可逆性由去泛素化酶（DUBs）精细调控。SUMO蛋白也通过类似的酶级联反应（E1、E2、E3）与靶蛋白结合，并可被SUMO特异性蛋白酶（SENPs）去卷积。泛素化和SUMO化通路通过一类特殊的酶——SUMO靶向泛素连接酶（STUbLs）相交汇，这些酶能识别SUMO化底物并为其添加泛素链，从而调控其降解或活性。

The role of ubiquitination in maintaining genomic integrity during normal DNA replication

复制起点许可和复制起始

真核细胞DNA复制始于G1期前复制复合体（pre-RC）的形成。起源识别复合体（ORC1-6）在ORCA等因子辅助下结合复制起点。E3泛素连接酶RFWD3通过泛素化ORCA稳定pre-RC。CDC6和CDT1协助加载MCM2-7解旋酶形成pre-RC。为防止重复复制，细胞通过CRL4^Cdt2等E3连接酶严格控制CDC6和CDT1的水平。

复制起点激活和复制延伸

进入S期后，CDK和DDK磷酸化MCM2-7，促进活性CMG解旋酶（CDC45-MCM-GINS）的组装。近期发现的E3连接酶OBI1（RNF219）通过多单泛素化ORC3和ORC5调控起点选择。即使在起点序列明确的酵母中，pre-RC组分的PTM对起点激活的调控也高度保守。未被激活的pre-RC可作为备用或休眠起点，在复制叉崩溃时确保基因组复制。

RNF4在复制起始和重启中的作用

RNF4是一个重要的STUbL。活跃复制叉周围的染色质富含SUMO而泛素较少，复制后染色质则相反。USP7通过拮抗SUMO和SUMO化蛋白的泛素化来维持复制叉环境。在复制叉长时间停滞或崩溃时，RNF4对于激活停滞叉附近的休眠起点至关重要，并通过调控FANCA和FANCD2-I（D2-I）等FA蛋白的周转来促进复制叉重启。

复制终止和CMG解组装

复制终止涉及CMG解旋酶的解体。在酵母中由SCF^Dia2介导，后生动物中则由CRL2^Lrr1介导MCM7的K48连接的多聚泛素化，并由p97/VCP/CDC48 ATPase识别并将其从DNA上卸载。在复制应激或有丝分裂期，E3连接酶TRAIP（RNF206）催化MCM7的K6和K63连接的多聚泛素化，提供另一条CMG解组装途径。RNF8等酶也参与此过程。

PCNA在非应激条件下的泛素化和SUMO化

在非应激条件下，PCNA在K164位点的泛素化是进化保守的，有助于DNA损伤耐受。PCNA的SUMO化（酵母中在K164和K127）则抑制姐妹染色单体间的非法重组。在酵母中，SUMO化的PCNA招募Srs2解旋酶，置换RAD51纤丝抑制同源重组。其人类同源物PARI具有类似功能。PCNA的修饰仅发生在染色质结合状态，其加载和卸载由复制因子C（RFC）复合体调控。

Replication stress and fork recovery mechanisms

DNA损伤耐受（DDT）通路修复复制缺口

当复制叉遇到障碍时，会积累ssDNA并被RPA覆盖。RPA招募E2酶RAD6和E3连接酶RAD18，促进PCNA在K164位点的单泛素化。这有助于易错翻译合成（TLS）。随后，由Ubc13/Mms2和Rad5（哺乳动物中为HLTF或SHPRH）催化K63连接的多聚泛素化，则促进以姐妹染色链为模板的无错误模板转换（TS）。先导链和滞后链的损伤旁路机制存在差异，滞后链损伤更容易导致复制后缺口的形成。

RAD18的调控

RAD18的招募和活性受到精密调控。PARP10通过修饰RAD18促进PCNA泛素化。ATR激酶通路则通过磷酸化RAD18的S403位点负调控其与PCNA的相互作用。RFWD3也参与DDT过程。

PCNA去泛素化

PCNA的去泛素化对于恢复高保真DNA合成和防止TLS聚合酶过度突变至关重要。USP1是负责去除PCNA单泛素化的关键DUB，需要辅因子UAF1。USP7也参与PCNA去泛素化，主要抑制氧化应激诱导的突变。

PRIMPOL活性填补复制缺口

PRIMPOL是一种具有引物酶和聚合酶活性的DDT蛋白。它在S期和G2期通过不同机制参与缺口修复。在S期更依赖TLS，而在G2期重新引发成为主导途径。PRIMPOL在先导链模板损伤下游进行重新引发，产生ssDNA缺口，随后由TLS进行复制后填补。

复制叉反转作为一种叉保护机制

复制叉反转是一种关键的保护机制，涉及亲本DNA链重新退火和新合成链退火，形成四向Holliday连接点样结构。ZRANB3通过其NPL4锌指结构域识别PCNA上的K63多聚泛素链被招募到停滞叉。SMARCAL1和HLTF也促进叉反转。RNF4通过调控TOP2A等靶点来限制过度的叉重塑。

崩溃复制叉向核孔复合体（NPC）的迁移受ATR和SUMO调控

SUMO化动力学在复制叉崩溃的细胞反应中至关重要。在酵母中，持续的叉停滞或崩溃会启动一个特殊的修复程序，涉及将受损叉迁移到NPC，这个过程高度依赖SUMO信号。SUMO化的RPA等蛋白有助于叉的迁移，局部的STUbL活性则介导RPA的移除，从而在严格的时空控制下使RAD51核蛋白纤丝形成。

FA and replication traverse of DNA interstrand crosslinks

FA通路

范可尼贫血（FA）通路在修复DNA链间交联（ICL）中起核心作用。FA是一种罕见的遗传病，由23个FA通路基因之一突变引起。FA核心复合体包含FANCA、FANCB、FANCC等多个蛋白，其中FANCL是E3泛素连接酶，负责FANCD2和FANCI的单泛素化。FANCM则是一个DNA转位酶。单泛素化的FANCD2与FANCI形成异源二聚体（D2-I），像钳子一样夹在DNA上，协调核苷酸切除修复、TLS和同源重组（HR）等多种修复机制。

复制穿越（Replication traverse）

令人惊讶的是，细胞能够耐受ICL，通过一个称为“复制穿越”的过程绕过它们，并进行复制后修复。研究表明，约70%的ICL是被穿越而非在S期切除修复。这个过程依赖FANCM/MHF复合体，它与复制体组分相互作用，促进复制叉重塑和穿越，GINS以ATR依赖的方式从CMG复合体上解离。穿越后，DNA合成在ICL远端以原始方向恢复。

ICL修复

关于ICL修复的启动机制仍有争议。一些模型认为单个停滞叉足以启动修复，而另一些则表明需要两个相对的复制叉在ICL处汇合。FANCM及其辅助蛋白作为传感器识别ICL处的停滞叉。D2-I单泛素化下游，多种核酸内切酶（如XPF-ERCC1）在SLX4支架蛋白作用下参与ICL的“钩出”（unhooking）。随后，TLS聚合酶进行损伤旁路，HR则修复产生的DSB。

FANCD2单泛素化

FANCD2在K561位点的单泛素化对ICL修复至关重要。D2-I复合体以多种构象状态存在，受PTMs和特定DNA结构调控。目前认为，D2-I复合体首先作为一个开放的钳子环绕DNA扩散，遇到dsDNA-ssDNA连接处（如停滞叉）时，在FA核心复合体和ATR磷酸化的作用下发生构象变化，闭合钳子并暴露泛素化位点。单泛素化稳定了复合体在DNA上的结合，并作为支架招募后续修复因子。

FANCD2–FANCI的PTM调控

D2-I复合体在DNA损伤位点的招募和保留受到复杂PTM网络的精密调控。传统的去泛素化由USP1-UAF1复合体介导。在CDK驱动的复制应激下，E3连接酶FBLX12会以CHK1依赖的方式多聚泛素化FANCD2，导致其被蛋白酶体降解。此外，SUMO化也参与调控：在基因毒性应激下，PIAS1/PIAS4和UBC9介导D2-I的SUMO化，随后被STUbL RNF4识别并添加泛素链，进而被p97提取和解体。

FA蛋白在叉保护中的不同作用

FANCD2富集在停滞的复制叉上，在叉保护和稳定性中起关键作用。它通过抑制核酸酶（如DNA2、MRE11）活性来保护新生DNA。单泛素化的FANCD2还促进BRCA2招募到染色质上，有助于RAD51加载。此外，FANCD2还参与复制体监视，在复制应激时与磷酸化的MCM2-7结合，调节解旋酶进程，防止ssDNA过度积累。

TRAIP是ICL修复的关键调控因子

在复制叉与ICL汇合时，CMG解旋酶通过E3连接酶TRAIP介导的MCM7多聚泛素化和p97依赖的卸载是FA通路激活的关键步骤。CMG的移除允许复制叉在损伤位点附近暂停，从而招募FANCM等修复因子。TRAIP在ICL修复中的重要性体现在其缺失会使细胞对MMC敏感。

Replication completion and mitotic recovery

有丝分裂DNA合成（MiDAS）及其在DNA修复中的作用

尽管有S期的ATR检查点激活，某些基因组区域仍可能复制不足并持续到有丝分裂期。这些区域通过一种称为MiDAS的特殊途径解决。MiDAS是一种保守的DNA合成过程，以姐妹染色单体为模板，与断裂诱导复制（BIR）有相似之处。MiDAS发生在常见的脆弱位点（CFSs）和端粒等易受复制应激影响的基因座，对于维持基因组稳定性至关重要，其失败会导致后期超细桥（UFBs）和染色体分离错误。

FANCD2是MiDAS的关键调控因子。FA核心复合体组分以及SLX4、RAD52、RAD51、POLD3、PCNA泛素化（由RAD18催化）等都是MiDAS所必需的。E3连接酶TRAIP在有丝分裂期通过多聚泛素化降解残留的CMG复合体，这对于启动MiDAS至关重要。在BRCA2缺陷细胞或 cyclin E过表达等情况下，MiDAS会被激活。端粒区域的MiDAS在ALT细胞中尤为活跃。

Conclusions and future directions

泛素和类泛素修饰剂在DNA复制及相关修复通路中扮演着核心角色。活跃复制体的高度SUMO化与复制后/停滞叉的泛素化介导的蛋白周转形成鲜明对比。对滞后链合成和Okazaki片段成熟的调控机制有了新的认识。E3连接酶TRAIP在复制终止、ICL修复和MiDAS中的核心作用日益凸显。对“复制穿越”机制的深入理解可能揭示癌细胞对交联剂耐药的新途径。随着蛋白质降解靶向嵌合体（PROTAC）等技术的发展，针对特定E3连接酶或SUMO化通路的关键蛋白成分可能为癌症治疗提供新的策略。