利用CASX2Max增强基因组CCR5的切割效果

《RNA Biology》：Enhanced cleavage of genomic CCR5 using CASX2Max

CRISPR/Cas系统通过gRNA与Cas蛋白结合实现基因编辑，其中CasX2（PlmCas12e）因较小的尺寸、不同的PAM序列（TTCN）和5'过hang断裂特性备受关注。本文比较了CasX2与改良版CasX2Max在CCR5基因编辑中的效率，发现CasX2Max通过三个氨基酸突变（T26R、K610R、K808R）显著增强基因组切割能力，其机制涉及增强sgRNA-DNA结合稳定性及优化DNA折叠结构，使MMEJ修复介导的16-32bp缺失更高效。实验通过纳米孔测序验证了结构变化与功能提升的关联性，并证实CasX2Max与SaCas9相当。

　　基因编辑技术在治疗多种遗传性疾病方面展现出巨大的潜力，而CRISPR/Cas系统是其中最具代表性的工具之一。CasX2（也称为PlmCas12e）是一种源自非致病性细菌Planctomycetes的II类CRISPR系统，相较于常见的Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）和Staphylococcus aureus Cas9（SaCas9），CasX2在基因编辑领域展现出诸多优势，包括更小的分子量、独特的PAM序列识别要求、产生带有5’突出末端的双链断裂（DSB）以及人类体内缺乏对它的先天免疫反应。这些特性使得CasX2成为一种有前景的基因编辑工具，尤其在需要高精度和低免疫反应的治疗应用中。

本研究的目的是评估CasX2及其改良版本CasX2^Max在靶向CCR5基因时的切割效率和DSB修复特征。CCR5基因编码的受体在HIV-1感染过程中发挥关键作用，因此它成为基因编辑研究的重要靶点。通过设计两种单向导RNA（sgRNA），即sg5和sg10，这两种sgRNA的spacer长度分别为17、20和23个核苷酸（nt），并且能够靶向CCR5基因中被自然缺失的32个碱基对区域。实验结果表明，CasX2在使用17 nt spacer的sgRNA时无法有效切割基因组中的CCR5，而CasX2^Max则能够实现有效切割，尤其是在20 nt和23 nt spacer长度的情况下。这一结果提示，CasX2^Max在细胞内具有更强的靶向能力和切割效率。

CasX2和CasX2^Max的结构建模进一步揭示了其性能差异的分子基础。CasX2^Max的三个氨基酸替换，包括T26R、K610R和K808R，分别增强了sgRNA-DNA杂交稳定性、促进了DNA在催化位点的对齐，以及优化了酶与DNA骨架的相互作用。这些结构变化可能直接导致CasX2^Max在细胞内的切割效率显著提高。例如，T26R和K610R的替换增强了在PAM附近DNA单链分离的稳定性，从而促进了R-loop的形成，这是CRISPR系统中一种关键的中间结构。而K808R的替换则在两个不同的催化阶段（NTS切割和TS切割）中加强了酶与DNA骨架的接触，有助于稳定靶向DNA的位置，提高切割效率。

此外，研究还发现CasX2^Max在细胞内的切割效率与SaCas9相当，尤其是在靶向CCR5基因时。通过Nanopore测序和CRISPResso2分析，研究者观察到CasX2^Max在细胞内能够引发一致的16-32 bp缺失，这些缺失符合微同源末端连接（MMEJ）的特征。相比之下，CasX2在切割细胞内的CCR5基因时，更倾向于产生插入突变，这可能与其在催化过程中的稳定性较低有关。这些发现表明，CasX2^Max的结构修饰不仅提高了其在细胞内的切割效率，还改变了其在修复过程中选择的机制，从而提高了基因编辑的精准度和效果。

研究还探讨了CasX2在不同状态下的结构变化，特别是其在催化非活性状态（state III）中的表现。在state III中，由于氧化反应导致的锌指结构塌陷，CasX2的切割能力受到显著抑制。CasX2^Max的K808R替换有助于恢复这种结构，使其在state III中仍能保持对NTS的接触，从而降低进入非活性状态的可能性，并提高进入活性状态的效率。这种结构上的稳定性变化可能对CasX2在细胞内的功能至关重要，尤其是在需要长期或重复应用的治疗场景中。

通过使用双sgRNA（sg5和sg10）与CasX2^Max进行靶向切割，研究者还观察到了基因组DNA的精确删除。这种双sgRNA策略在CasX2^Max的介导下，能够有效移除CCR5基因中位于两个靶向区域之间的序列，从而实现对基因功能的完全破坏。这一结果不仅展示了CasX2^Max在基因编辑方面的潜力，也为开发针对特定基因的基因治疗方案提供了新的思路。

研究的另一个重要发现是，CasX2^Max在不同类型的DNA靶向中表现出类似的切割效率，包括隔离DNA和基因组DNA。这表明CasX2^Max不仅适用于特定的实验条件，还具有广泛的适用性。在与SaCas9的比较中，CasX2^Max在切割效率和基因编辑效果上均表现出显著的优势，特别是在需要高精度和低免疫反应的治疗应用中。

总的来说，CasX2^Max的开发和应用为基因编辑技术提供了新的方向。它不仅克服了原始CasX2在细胞内切割效率低下的问题，还展示了与SaCas9相当的性能，同时避免了与人类免疫系统的潜在冲突。这些特性使得CasX2^Max成为一种极具潜力的基因编辑工具，尤其适用于治疗HIV-1等依赖于特定基因表达的疾病。此外，研究还揭示了CasX2^Max的结构变化如何影响其在细胞内的功能，这为未来的酶工程和基因编辑策略提供了理论依据和实践指导。随着对CasX2^Max的进一步研究和优化，它有望在未来的基因治疗中发挥更大的作用，为科学家和临床医生提供更高效的基因编辑解决方案。