靶向mRNA递送新策略：pH响应性胍基脂质纳米颗粒增强癌症免疫治疗

《SCIENCE ADVANCES》：Ionizable guanidine-based lipid nanoparticle for targeted mRNA delivery and cancer immunotherapy

本研究针对传统胺基LNP靶向免疫器官效率低、抗原呈递不足的难题，开发了新型pH响应性离子化胍基脂质纳米颗粒（G-LNP）。该平台通过静脉注射可实现mRNA的高效脾脏靶向递送，并特异性靶向抗原呈递细胞，显著增强抗原呈递和T细胞活化。G-LNP mRNA疫苗可激发强大的抗原特异性免疫反应，完全抑制肿瘤进展，为癌症免疫治疗提供了极具前景的递送平台。

　　

信使RNA（mRNA）技术的崛起，特别是其在新型冠状病毒疫苗中的成功应用，标志着生物医药领域进入了一个新时代。然而，将mRNA这种脆弱的大分子安全、有效地递送到人体内特定的细胞或器官，并使其发挥治疗作用，仍是一个巨大的挑战。在众多递送工具中，脂质纳米颗粒（LNP）是目前最主流的平台。传统的LNP通常使用胺基（amine-based）脂质，这些脂质在酸性的内涵体环境中会被质子化，从而帮助mRNA逃逸到细胞质中发挥作用。但这类LNP有一个明显的“偏好”：它们更倾向于将mRNA递送到肝脏，而对于免疫反应的关键战场——脾脏，其靶向效率往往不尽如人意。这严重限制了mRNA技术在癌症免疫治疗等领域的应用潜力，因为有效的抗癌免疫需要mRNA疫苗能够精准地作用于脾脏等免疫器官中的抗原呈递细胞（Antigen-Presenting Cell, APC），从而激活T细胞，发起对癌细胞的攻击。

那么，能否设计一种全新的LNP，让它能像“智能导航车”一样，主动寻找并进入脾脏的免疫细胞，并高效释放其携带的mRNA“指令”呢？发表在《SCIENCE ADVANCES》上的一项研究给出了肯定的答案。研究人员独辟蹊径，将目光投向了另一种化学基团——胍基（guanidine），开发出了一类新型的离子化胍基脂质纳米颗粒（Guanidine-based LNP, G-LNP），成功实现了脾脏靶向的mRNA递送，并引发了强大的抗肿瘤免疫反应。

为开展本研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，他们设计并合成了九种带有胍基羰基吡咯（Guanidino-carbonyl-pyrrole, GCP）头基的脂质分子，并利用体外细胞模型（如HeLa细胞）进行高通量筛选，以评估其mRNA递送效率。其次，他们采用动态光散射（DLS）和TNS荧光测定法系统地表征了优选LNP的粒径、电位和表观pK_a值，并利用冷冻电镜（cryo-EM）观察其在不同pH条件下的微观结构。再者，通过体外溶血实验和ANTS（8-氨基萘-1,3,6-三磺酸）染料释放实验，评估了LNP的膜破坏能力和内涵体逃逸潜力。最后，研究团队在Balb/c和C57BL/6小鼠模型中进行了深入的体内实验，通过静脉和腹腔注射不同LNP制剂，利用活体成像技术追踪mRNA的表达分布，并借助流式细胞术详细分析了脾脏和肝脏中免疫细胞（如树突状细胞DC、巨噬细胞、T细胞）的转染效率、活化状态以及抗原特异性免疫应答，从而全面评估了G-LNP作为肿瘤疫苗的预防和治疗效果。

RESULTS

G-LNPs exhibit enhanced mRNA delivery performances in vitro

研究人员首先设计并合成了9种具有GCP头基的胍基脂质（GL lipids）。GCP单元具有较低的pK_a值（约7），使其在酸性条件下呈现pH响应性。初步筛选发现，具有较长疏水尾链的GL5脂质表现最佳。通过正交筛选法优化LNP各组分的摩尔比，他们获得了多个性能优于当前基准LNP（SM102）的配方。值得注意的是，即使在不含胆固醇的三组分LNP中，某些配方（如GL5-3）也表现出卓越的mRNA递送能力，其效率与SM102相当甚至更高。最佳脂质/mRNA重量比确定为40:1。

GL5 LNPs demonstrate optimal physiochemical property and pH responsiveness

优选出的GL5 LNP（包括三组分的GL5-3和四组分的GL5-4）具有理想的理化性质。GL5 LNP的表观pK_a值较高（7.0-7.9），粒径更小（89-118纳米），在pH 7.4的PBS缓冲液中表面电位呈微负电性。冷冻电镜显示，G-LNPs在溶液中呈现多层结构，且在酸性（pH 5.0）缓冲液中结构完全解离并重排为不规则聚集体，这种高度的pH敏感性有利于mRNA在酸性内涵体环境中的细胞内释放。

Endosomal escape properties of GL5 LNPs

细胞摄取追踪实验表明，不含胆固醇的GL5-3在24小时后能将大量mRNA从内涵体/溶酶体释放到细胞质中。进一步的机制研究表明，G-LNPs在酸性条件下能有效破坏模拟内涵体膜的大型单层脂质体（LUV），释放其内包裹的ANTS染料。溶血实验也证实，GL5-3在酸性pH下具有超过90%的膜裂解效率，而其在生理pH下活性很低，这表明质子化后的胍基脂质能更有效地与内涵体膜上的阴离子物质相互作用，促进mRNA的胞质释放。

GL5 LNPs achieve targeted mRNA delivery in vivo

体内实验是本研究的关键。静脉注射后，GL5 LNP能成功将功能性荧光素酶mRNA递送至远端器官。其中，不含胆固醇的GL5-3表现出优异的脾脏靶向特异性，而含有胆固醇的GL5-4则将mRNA递送至脾脏和肝脏。相比之下，胺基LNP SM102主要靶向肝脏。研究还发现，胆固醇的含量与肝脏累积呈正相关，去除胆固醇有利于脾脏等肝外器官的靶向。此外，通过腹腔注射，G-LNPs（尤其是GL5-3）还能将mRNA选择性递送至胰腺、胃和肠道，展现了其递送途径的多样性。

GL5 LNPs induce robust antitumor immune responses

基于G-LNP卓越的脾脏靶向能力，研究人员进一步评估了其作为癌症mRNA疫苗的潜力。流式细胞术分析显示，GL5-3和GL5-4能高效地将mRNA递送至脾脏中的抗原呈递细胞（APC），特别是树突状细胞（DC）和巨噬细胞，其转染效率显著高于SM102。当用编码模型抗原卵清蛋白（OVA）的mRNA制备疫苗时，G-LNP formulations（GL5-3和GL5-4）在肿瘤攻击模型中提供了完全的保护，所有小鼠在30天内均未出现肿瘤生长，而SM102组仅有40%的小鼠得到保护。机制研究表明，G-LNPs能显著上调APC表面MHC-I分子呈递的SIINFEKL肽段（源自OVA），并增强共刺激分子CD86的表达。更重要的是，G-LNPs能强力激活T细胞：GL5-3激活了超过48%的CD4⁺ T细胞和40%的CD8⁺ T细胞（以CD69为标记物），而SM102仅激活了5%的CD4⁺和7%的CD8⁺ T细胞。在治疗已建立肿瘤的模型中，G-LNPs也能显著抑制肿瘤生长并延长生存期。此外，在肿瘤再攻击实验中，接种过G-LNP疫苗的小鼠表现出持久的免疫记忆，能够完全抵抗更高剂度的肿瘤细胞攻击，其脾脏中产生了效应记忆T细胞（T_em）和中枢记忆T细胞（T_cm）。

DISCUSSION

本研究成功开发了一类新型的离子化胍基脂质纳米颗粒（G-LNP），为解决传统胺基LNP在脾脏靶向和免疫激活方面的局限性提供了创新性解决方案。特别是胆固醇游离的三组分GL5-3 LNP，展现了卓越的脾脏靶向特异性。G-LNPs的优势不仅在于器官水平的靶向，更在于其细胞水平的偏好性——优先靶向抗原呈递细胞，并显著增强抗原呈递和T细胞活化能力。与SM102相比，G-LNPs诱导的CD4⁺ T细胞活化水平高出十倍以上，这对于建立持久的体液免疫和可能的表位扩散至关重要。同时，G-LNPs激活的特定CD8⁺ T细胞亚群可能与其观察到的长效免疫记忆有关。该平台的 versatility 也通过腹腔注射实现胰腺等器官靶向得以体现。综上所述，胍基LNPs代表了一类具有增强抗原呈递和免疫激活特性的新型LNP平台，为推进mRNA癌症疫苗和其他靶向治疗策略开辟了新的途径。