PLEKHM2 mRNA解码过程中的程序性核糖体移码产生支持心肌功能的组成型活性蛋白变体

《SCIENCE ADVANCES》：Programmed ribosomal frameshifting during PLEKHM2 mRNA decoding generates a constitutively active proteoform that supports myocardial function

本研究针对脊椎动物细胞基因中程序性核糖体移码（PRF）功能未知的问题，开展了对PLEKHM2基因+1 PRF事件的研究。研究人员发现该移码事件产生了一个组成型活性蛋白变体PLEKHM2-FS，其与规范翻译的PLEKHM2-CT协同作用，对于恢复心肌细胞收缩功能至关重要，揭示了PRF在心脏功能中的新机制，为相关心脏病治疗提供了新靶点。

　　

在生命体精密调控的蛋白质合成过程中，核糖体通常像一台严谨的阅读器，沿着信使RNA（mRNA）的密码子逐字逐句地翻译，确保遗传信息的准确传递。然而，自然界也存在一种被称为“程序性核糖体移码”（Programmed Ribosomal Frameshifting, PRF）的巧妙机制，它允许一部分核糖体在特定信号指导下“跳格”阅读，从而从同一条mRNA模板上合成出功能不同的蛋白质。这种策略在病毒中尤为常见，例如HIV-1和流感病毒都利用PRF来最大化其有限基因组的编码能力。然而，在脊椎动物自身基因中，除了一个用于合成抗酶（antizyme）的特例外，尚未有确凿证据表明存在能够通过PRF产生内部重叠开放阅读框（ORF）并生成两种功能蛋白的案例。是否存在这样的机制？如果存在，它在高等生物的生理过程中扮演着什么角色？这些问题一直吸引着科学家们的探索。

为了回答这些问题，一项发表在《科学进展》（SCIENCE ADVANCES）上的研究将目光投向了一个名为PLEKHM2（也称为SKIP）的人类基因。研究人员发现，在解码PLEKHM2的mRNA时，会发生一种+1移码事件，从而产生一个组成型活性的蛋白变体，该变体对于维持正常的心肌功能至关重要。

为开展此项研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法。这些方法包括生物信息学分析（如同源序列比对、Synplot2、MLOGD和PhyloCSF算法预测重叠阅读框和进化保守性）、双荧光素酶报告基因系统定量检测PRF效率、基于质谱的蛋白质组学鉴定移码连接肽段、细胞生物学技术（如免疫荧光显微镜观察蛋白质亚细胞定位、免疫共沉淀分析蛋白质相互作用、在野生型和ARL8基因敲除的HeLa细胞中进行功能表征）以及基于人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）的疾病模型构建（利用CRISPR-Cas9技术敲除PLEKHM2）和心肌收缩力等功能评估。

PLEKHM2表达涉及一个高度保守的+1 PRF

研究人员首先通过生物信息学分析，在PLEKHM2基因的一个编码外显子中发现了一个保守的重叠ORF，该ORF无法通过任何RNA同种型的规范翻译访问。在该替代ORF的5‘端附近，存在一个潜在的+1 PRF序列“UCC_UUU_CGG”，该序列与流感A病毒的+1 PRF位点几乎相同，并且在脊椎动物的PLEKHM2 mRNA中高度保守。通过Synplot2、MLOGD和PhyloCSF等多种生物信息学工具对哺乳动物、蜥形类（鸟类等）、两栖类和硬骨鱼的序列进行分析，均一致显示在PLEKHM2基因被FS ORF重叠的区域，+1阅读框具有统计学上显著增强的同义位点保守性和正编码信号，强烈提示该区域在+1框架下经受着纯化选择压力。对100种脊椎动物的全基因组比对进一步证实，PRF信号关键部分（CC_UUU_C六核苷酸）和FS终止密码子在所有比对物种中都存在，并且在潜在双编码区的后部，相对于+1框架存在大量的同义置换，同时该区域内+1框架没有终止密码子。这些证据共同指向PLEKHM2 mRNA中存在一个进化上保守的+1 PRF事件。利用ColabFold对假设PRF产生的蛋白结构进行预测，结果显示规范翻译的PLEKHM2-CT（C-terminal）蛋白的N端部分结构可信，而预测的FS蛋白在其移码部分包含一个高置信度的α螺旋结构域。

PLEKHM2中+1 PRF的实验证据

为了验证生物信息学的预测，研究团队进行了实验验证。他们将推测的PLEKHM2移码位点及侧翼序列插入到海肾荧光素酶（Renilla luciferase）和萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）的编码序列（CDS）之间构建报告载体。在人类胚胎肾细胞（HEK293T）中表达后，免疫印迹实验证实野生型（WT, UCC_UUU_CGG）构建体能够产生约100 kDa的两种荧光素酶融合蛋白，而突变PRF信号（agC_UUc_aGa）后则无法产生，直接证明了PRF的发生。通过优化的双荧光素酶报告系统定量测量，发现PLEKHM2的PRF效率约为1.3%，与流感病毒的PRF效率（~1%）相当。研究人员还注意到移码位点3‘端有一个茎环（stem-loop）结构，但通过突变破坏、恢复或增强该结构后发现，其对于PRF的刺激作用并非必需，这一点与流感病毒类似，表明PLEKHM2仅需其“ slippery site ”即可诱导+1 PRF。此外，添加多胺（如亚精胺）能将PLEKHM2和已知的+1 PRF基因OAZ1的移码效率均提高约1.5倍，表明PLEKHM2的PRF效率是可调控的。为了精确确定移码位点和方向，研究团队构建了将绿色荧光蛋白（GFP）与移码CDS3’端融合的表达载体，通过亲和纯化和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，成功鉴定出跨越移码位点的肽段，确凿地证实了移码发生在“UCC_UUU_CGG”位点，方向为+1。

+1 PRF模序在脊椎动物mRNA中的广泛存在

鉴于YCC_UUU_CG这一+1 PRF模序在PLEKHM2和流感病毒中都能有效诱导移码，研究人员调查了该模序在其他脊椎动物mRNA中的存在情况。通过对17,922个人类CDS与其同源序列（氨基酸一致性≥65%）的比对分析，发现了4128个YCC_UUU_CG实例，其保守程度各异。这表明YCC_UUU_CG介导的+1 PRF可能在脊椎动物中广泛存在，甚至可能产生在系统发育上受限但具有重要功能的新蛋白（de novo proteins）。例如，尽管NUP210L基因中的该模序保守性有限，但其预测的移码产物能形成一个高置信度的β链，可能完善其所在的结构域。这提示此类PRF事件可能是新蛋白产生和进化的一种途径。

PLEKHM2-FS蛋白变体是组成型活性的

接下来，研究团队探究了PLEKHM2-FS蛋白变体的功能活性。已知的PLEKHM2-CT蛋白包含一个与溶酶体相关小GTP酶ARL8相互作用的RUN结构域、与驱动蛋白-1（kinesin-1）相互作用的WD-WE模序、一个大部分无序的区域以及三个自抑制的PH结构域。ARL8不仅将PLEKHM2-CT招募至溶酶体，还解除其自抑制，使其能够作为衔接蛋白，介导ARL8依赖的溶酶体与kinesin-1的偶联，从而驱动溶酶体向微管正端（细胞外周）运输。而PRF产生的PLEKHM2-FS保留了RUN结构域和WD-WE模序，但缺失了部分无序区和三个PH结构域。细胞实验表明，在野生型HeLa细胞中过表达PLEKHM2-CT、PLEKHM2-FS或缺失PH结构域的截短体（PLEKHM2 1-437），均能导致溶酶体（标记物为LAMP1和LAMTOR4）重新分布至细胞尖端。在ARL8双敲除（ARL8-KO）的HeLa细胞中，过表达的PLEKHM2-CT无法再招募溶酶体或自身定位到细胞尖端。然而，令人惊讶的是，PLEKHM2-FS虽然也不能再驱动溶酶体运输（因其仍需要ARL8来锚定于溶酶体），但其自身却能够在缺乏ARL8的情况下仍然移动到细胞尖端。相比之下，PLEKHM2 1-437在ARL8-KO细胞中的尖端定位能力显著减弱。这表明PLEKHM2-FS不仅是组成型活性的（不依赖ARL8激活），其FS序列还可能通过增强自身相互作用（免疫共沉淀实验显示FS变体自相互作用更强）以及与kinesin-1的结合（免疫共沉淀证实FS变体结合更多KIF5B，即kinesin-1重链），从而促进了其运动能力。因此，PLEKHM2-FS作为一个组成型活性的变体，可能在基础水平的溶酶体运输或激活规范PLEKHM2-CT方面发挥作用。

PLEKHM2-FS蛋白变体有助于心肌细胞收缩活动

溶酶体的正常功能和定位对于自噬等过程至关重要，而在心脏中尤为关键。此前研究发现，PLEKHM2的突变与扩张型心肌病（DCM）和左心室致密化不全（LVNC）相关。本研究进一步发现，PLEKHM2-FS的蛋白序列在脊椎动物中的保守程度甚至高于大多数直系同源蛋白，其保守性与脊椎动物 chambered heart（腔室心脏）系统的出现相吻合，暗示其在心脏功能中的重要作用。为了验证这一假设，研究人员利用CRISPR技术构建了PLEKHM2敲除（KO）的人诱导多能干细胞（hiPSC），并将其分化为心肌细胞（hiPSC-CMs）。与野生型相比，PLEKHM2-KO的心肌细胞表现出心肌收缩力丧失、心衰生物标志物（NPPA, NPPB）水平升高、钙处理异常以及自噬受体p62/SQSTM1积累等病理表型。随后，他们用慢病毒载体分别向KO细胞中回补空载体、野生型PLEKHM2 cDNA、沉默滑移位点突变体（SSM，主要产生PLEKHM2-CT）、或同时回补SSM（产生CT）和移码阅读框内对照突变体（产生FS）。关键结果表明，仅回补SSM（即主要提供PLEKHM2-CT蛋白）并不能显著恢复KO心肌细胞的收缩力、收缩速度等指标。而只有当同时回补能够产生PLEKHM2-CT和PLEKHM2-FS两种蛋白变体的构建体时，心肌收缩功能才得到显著恢复，达到接近野生型的水平。这清晰地证明，无论是规范翻译的PLEKHM2-CT，还是通过PRF产生的PLEKHM2-FS，都是恢复正常心肌收缩功能所必需的。

综上所述，本研究首次在脊椎动物细胞基因中实验证实了能够访问内部重叠ORF的程序性核糖体移码事件。该事件发生在PLEKHM2基因上，产生一个组成型活性的蛋白变体PLEKHM2-FS。该变体不依赖于ARL8的激活即可与kinesin-1有效互作，并与规范翻译的PLEKHM2-CT协同作用，对于维持正常的心肌收缩功能至关重要。这一发现不仅将PRF现象的研究领域从病毒扩展到了脊椎动物自身基因，揭示了基因表达调控的一种新层次，而且为理解相关心脏疾病的分子机制提供了新的视角，提示调控PRF效率可能成为未来治疗干预的新策略。此外，研究还表明YCC_UUU_CG这一PRF模序在脊椎动物mRNA中广泛存在，预示着可能还存在大量未被发现的具有生物学功能的细胞基因PRF事件，为后续研究开辟了新的方向。尽管PLEKHM2-FS的保守性与心脏发育相关，但其在神经系统、免疫和癌症等依赖溶酶体分布和自噬的其他生理病理过程中的潜在作用仍有待进一步探索。