基于生物传感器的恶臭假单胞菌工程改造揭示最大化异戊二烯醇生产的关键细胞过程

《SCIENCE ADVANCES》：Biosensor-driven strain engineering reveals key cellular processes for maximizing isoprenol production in Pseudomonas putida

本刊推荐：针对短链醇类生物燃料开发中高通量筛选与生产瓶颈的难题，研究人员开展了基于生物传感器的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)菌株工程研究。他们发现并表征了一条非典型信号通路，揭示了一种混合组氨酸激酶(HHK)与醇脱氢酶(YiaY)的功能性物理复合体，并通过异源二聚化调节其活性。利用该生物传感器进行CRISPRi文库筛选，鉴定出关键的宿主限制因素。通过迭代组合菌株工程，使异戊二烯醇(isoprenol)滴度提高36倍至约900 mg/L。整合组学分析表明，代谢重编程转向氨基酸分解代谢是这一改进的关键。该模块化工作流程为优化复杂异源途径和揭示宿主生物学新机制提供了强大策略。

　　

在合成生物学迅猛发展的今天，微生物制造先进生物燃料为实现能源安全、减少工业化的环境足迹带来了战略机遇。异戊二烯醇(isoprenol)作为一种平台化学品，不仅具有作为柴油燃料混合组分的优越性能，更是生物航空燃料二甲基环辛烷(DMCO)的关键前体。然而，短链至中链醇类生物燃料的开发面临多重挑战：从分析角度看，醇类物质无色、易挥发的特性使得高通量测量方法在速度、成本和准确性之间难以兼顾；从生物学角度看，异源途径表达往往导致宿主生长缺陷、有毒中间体积累以及表型漂变等问题，增加了工业放大评估的风险。

传统的气相色谱法虽能准确量化醇类产物，但其串行分析和耗时的样品制备限制了通量，难以应对基因组学视角下组合突变体搜索空间的巨大规模。因此，开发专门针对醇类筛选和生产挑战的新工具，成为推动生物燃料生产工艺快速发展的关键科学突破。

针对这一难题，发表在《SCIENCE ADVANCES》上的研究团队开发了一种创新的解决方案。他们聚焦于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440这一微生物底盘，巧妙地将该菌株能够分解异戊二烯醇的"劣势"转化为优势，重新设计了基于天然分解代谢途径的异戊二烯醇响应信号级联，为细胞内异戊二烯醇水平提供了读数。

研究人员开展了一项系统性的研究，首先利用功能基因组学数据开发了剂量依赖型的异戊二烯醇生物传感器，随后深入解析了其调控网络的关键组件，发现了一种前所未有的混合组氨酸激酶(HHK)与醇脱氢酶的功能性物理复合体。他们将优化后的生物传感器部署到统一的生产-传感菌株中，通过CRISPRi介导的选择性筛选鉴定出限制异戊二烯醇生产的非途径瓶颈，并通过迭代组合菌株工程显著提高了产量。最后，通过整合组学分析揭示了高产菌株中 previously unknown 的代谢重编程机制。

为开展这项研究，研究人员主要应用了几个关键技术方法：基于RB-TnSeq(随机条形码转座子测序)功能基因组学的生物传感器开发流程；蛋白质相互作用预测与验证技术(包括AlphaFold3多聚体分析和实验验证)；CRISPRi(CRISPR干扰)文库筛选与牛津纳米孔测序技术；以及整合组学分析(蛋白质组学和代谢组学)方法。

Development of a dose-dependent isoprenol biosensor

研究人员开发了一种从RB-TnSeq适应性数据构建生物传感器的通用方法。通过重新分析超过200个全基因组适应性实验的聚合数据集，他们进行了共适应性分析，以在不同条件下基于细微相关性识别功能相关的调控基因。该方法通过添加核糖体结合位点(RBS)优化步骤，将外源配体浓度与相应的荧光响应相匹配，扩展了早期报告中描述的生物传感器可调性。使用更新后的测定方法，他们从已发表的RB-TnSeq数据集中搜索转录调控因子，以识别在外源添加异戊二烯醇情况下生长所必需的基因。

Discovery of key components in the isoprenol biosensor regulatory network

生物传感器测定揭示了恶臭假单胞菌异戊二烯醇分解代谢中所有涉及的调控靶点中的必要天然信号组件。研究人员使用重组工程技术生成共适应性分析中鉴定的HHK和反应调节剂的等基因缺失突变体。实验结果表明，删除反应调节剂PP_2665会消除生物传感器响应，表明这是参与异戊二烯醇信号级联的主要调节剂。在评估的三个最有希望的候选组氨酸激酶(HK)中，只有ΔyiaZ突变体显示生物传感器激活丧失， pinpointing 这是异戊二烯醇诱导信号级联所需的特定HHK。相反，删除PP_2664略微增加了生物传感器的fold induction，表明可能存在减弱对异戊二烯醇反应的相互作用。

引人注目的是，质粒为基础的yiaZ回补未能恢复生物传感器活性，而包含更大基因组序列(包括PP_2681、yiaZ和yiaY)的回补则成功恢复了ΔyiaZ的生物传感器活性。失活yiaY起始密码子会导致回补失败，表明yiaY和yiaZ基因产物都是生物传感器活性所必需的。AlphaFold3多聚体分析预测了YiaY和YiaZ之间的潜在相互作用结构域，而实验验证表明YiaY的N端14个氨基酸与YiaZ的相互作用以及YiaY的催化活性对于异戊二烯醇激活调控级联都至关重要。

Alcohol signaling regulation is tuned by HHK dimer configuration

研究人员进一步确定了该生物传感器对其他潜在配体的特异性，调查了WT、ΔyiaZ和ΔPP_2664菌株中对更广泛短链醇的响应。使用等摩尔醇浓度，他们观察到在1位有支链的醇类(异戊二烯醇和异戊醇)在ΔPP_2664菌株中显示出强烈的25倍诱导，比WT强约2倍。而在2位有支链的醇类如3-甲基-1-戊醇则表现出相反的偏好，在WT背景下的激活更强。线性醇类如乙醇和己醇具有可变的fold response，范围从4倍到40倍，并且优先在WT菌株背景下被激活。

Deploying a unified biosensor-producer strain to identify nonpathway bottlenecks

研究人员通过将异戊二烯醇途径整合到恶臭假单胞菌基因组中，与生物传感器模块并列，构建了一个统一的生产和传感菌株。为了高通量选择，他们将生物传感器的荧光报告基因(mCherry)替换为条件必需基因pyrF，创建了一个生长耦合输出。这个集成菌株为使用荧光和生长为基础的读数来识别限制异戊二烯醇生产的宿主天然元件提供了基础。

CRISPRi-based selection using a growth-coupled isoprenol biosensor

研究人员将优化的传感器系统转换为一个无偏倚的选择系统，以有效识别限制异戊二烯醇生产的细胞过程。具体来说，他们通过用pyrF(来自Teredinibacter turnerae T7901的URA3同源物)替换mCherry，将更高浓度的异戊二烯醇与细胞生长耦合起来。随后，通过CRISPRi文库，他们旨在选择能够改善pedF诱导生长的候选基因敲低，作为更高异戊二烯醇滴度的代理。

Validation and combinatorial stacking of hits from the CRISPRi selection

研究人员通过测试相应的功能缺失缺失突变体，评估了从CRISPRi选择中鉴定的基因对异戊二烯醇生产的影响。他们观察了当缺失被组合时的加性、中性和抑制性相互作用。从这项无偏倚选择中恢复的靶点提供了一个包含未经测试和先前验证的宿主内在瓶颈的列表。一个关键的发现是，该CRISPRi选择成功地将鞭毛相关基因鉴定为高置信度命中，指导他们在后续轮次中选择fleQ作为提高异戊二烯醇滴度的靶点。

Functional genomics analyses reveal metabolic shifts in high isoprenol producers

为了表征这些增强的异戊二烯醇生产菌株中的细胞变化，研究人员使用了蛋白质组学和代谢组学的组学方法。他们评估了最优化的最终菌株TEAM-3174和TEAM-3185与起始菌株TEAM-2595，以表征当异戊二烯醇生产从50 mg/L增加到850 mg/L时的细胞变化。该分析的主要结论表明存在超出增加异戊二烯醇途径表达或减少产物降解的广泛代谢转变，并暗示了先前未描述的氨基酸代谢作用。

该研究揭示了决定高产异戊二烯醇的三个关键机制。首先，异戊二烯醇生产是一种 emergent cellular property，源于复杂的、不可预测的相互作用。其次，在生长阶段，高产异戊二烯醇菌株以相当的水平表达所有异戊二烯醇途径酶，但只有甲羟戊酸(而不是异戊二烯醇)积累。只有当葡萄糖耗尽时，才会发生一个"开关"，解锁异戊二烯醇的积累。第三，苯丙氨酸和亮氨酸在生产阶段积累，但只有苯丙氨酸补充能在生产阶段提高异戊二烯醇滴度。这种代谢重编程与偏好亮氨酸作为氮源而不是碳源一致。

这项研究的意义在于，它开发了一种将生物产品检测传感器与选择相结合的新方法，能够直接识别改善生物生产的机制。通过利用功能基因组学寻找生物传感器，并用理性方法优化其活性，研究人员建立了一个模块化的工作流程。生长耦合的生物传感器可以与突变体文库配对，实现对大量搜索空间的快速扫描，以获得所需的表型。该研究不仅显著提高了异戊二烯醇的产量，还为优化复杂异源途径和揭示宿主生物学新机制提供了强大的策略，对推动生物燃料和化学品生产的发展具有重要意义。