来自镰刀菌属（Fusarium spp.）的合成聚酯降解角质酶在黑曲霉（Aspergillus niger）中的异源表达与特性研究

《Microbiology Spectrum》：Heterologous expression and characterization of synthetic polyester-degrading cutinases from Fusarium spp. in Aspergillus niger

本研究筛选并鉴定了两种镰刀菌（F. oxysporum和F. redolens）的四类切割酶（Cut1和Cut5），利用CRISPR-Cas9系统在黑曲霉中高效表达，发现Cut5酶对合成聚酯Impranil-DLN和BHET具有显著降解活性，且结构特征与已知酶高度相似，为塑料生物降解提供了新候选酶。

　　近年来，随着环境污染问题的日益严重，寻找能够有效降解天然和合成聚合物的生物催化剂成为科学研究的重要方向。其中，一种名为“角质酶”（Cutinase）的酶因其广泛的底物特异性而备受关注。角质酶能够分解植物的角质层（Plant Cuticle），同时也表现出对合成聚酯材料如聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚己内酯（PCL）以及合成聚酯-聚氨酯分散体（如Impranil-DLN）的降解能力。这种酶的多功能性使其在环境修复、可持续材料回收等领域展现出巨大的应用潜力。尽管已有大量研究聚焦于细菌来源的角质酶，但真菌来源的角质酶仍存在研究不足，尤其是它们在非植物致病性场景中的酶活性尚未被充分探索。

在本研究中，科学家从两种内生性（endophytic）的镰刀菌（Fusarium）菌株中分离并鉴定了四种角质酶，并通过一种基于CRISPR-Cas9的多拷贝整合系统在黑曲霉（Aspergillus niger）中实现了高效表达。研究结果表明，这两种镰刀菌分别为镰刀菌尖孢（Fusarium oxysporum）和镰刀菌红变（Fusarium redolens）。通过对每种菌株的两个角质酶进行深入分析，研究团队发现它们在结构和功能上具有显著差异。其中，Cut1蛋白在两种菌株中表现出不同的氨基酸序列，而Cut5蛋白则与已知的能分解二羟乙基对苯二甲酸酯（BHET）的角质酶FoCut5具有较高的相似性。这些发现不仅揭示了角质酶的结构特征，也为理解其催化机制和应用潜力提供了重要依据。

研究团队还通过实验验证了这些角质酶在不同条件下的催化活性。例如，通过使用不同长度的对硝基苯基酯（para-nitrophenyl esters）作为底物，发现Cut5蛋白在C12长度的底物上表现出最高的活性。同时，通过优化pH和温度条件，确定了这两种角质酶的最适催化条件为pH 7和室温（20°C）。这些条件与镰刀菌的生长环境高度一致，表明角质酶的催化活性与其宿主的生理特性密切相关。此外，研究还发现，虽然Cut5蛋白在Impranil-DLN和BHET上均表现出降解活性，但Fr62Cut5在BHET上的活性显著低于Fo38Cut5，这可能与其序列差异和酶稳定性有关。

为了进一步探究这些角质酶的结构特征，研究团队利用AlphaFold等工具进行了预测建模，并与已知的FoCut5晶体结构进行了对比。结果表明，这些角质酶在结构上与FoCut5具有高度相似性，特别是在核心催化区域。然而，Cut1蛋白的表达和分泌效率较低，这可能是由于其信号肽和前肽结构的差异导致的。因此，研究团队提出未来可以尝试替换信号肽和前肽序列，以提高其在异源系统中的表达水平和跨物种的兼容性。

除了结构和功能研究，本研究还探讨了CRISPR-Cas9多拷贝整合系统的应用潜力。该系统能够在单个菌株中整合多个酶基因，从而实现定制化的酶组合。通过这种方式，科学家可以设计出具有协同效应的酶混合物，以提高聚合物降解效率。例如，黑曲霉角质酶HiC与酿酒酵母（Candida antarctica）脂肪酶的组合已被证明能够显著提高PET的降解效率。这种策略在工业和环境应用中具有广阔前景，尤其是在纺织、造纸、食品等行业的清洁生产中。

在表达和纯化方面，研究团队发现，虽然所有四种角质酶均能被成功表达，但Cut5蛋白的产量和纯度远高于Cut1蛋白。通过使用His标签和亲和层析技术，研究团队成功纯化了Cut5蛋白，并进行了详细的活性测试。结果表明，纯化的Cut5蛋白在Impranil-DLN和BHET上的降解能力显著，特别是在pH 7和室温条件下。而Cut1蛋白由于产量较低，难以进一步纯化和研究，这限制了其在实际应用中的潜力。

此外，研究团队还探讨了如何通过结构修饰和突变技术优化角质酶的催化性能。例如，通过引入额外的N-糖基化位点，可以提高角质酶的分泌效率和稳定性。这种策略在其他研究中已被证明能够显著改善酶的表达和功能。同时，通过定向突变或随机突变技术，可以生成针对不同底物或底物混合物的酶变体，从而扩大其应用范围。这些方法为未来开发高效、特异性强的角质酶提供了新的思路。

本研究不仅在理论层面揭示了角质酶的结构和功能特性，也在实践层面验证了其在聚合物降解中的潜力。通过比较不同菌株和不同酶变体的活性，研究团队为后续的工业化应用提供了重要的数据支持。同时，研究还指出，未来需要进一步探讨这些酶在不同环境条件下的稳定性、可扩展性和长期性能，以评估其在生物修复和可持续材料回收中的可行性。

总体而言，本研究展示了真菌来源的角质酶在降解天然和合成聚合物方面的潜力，并通过多拷贝整合系统实现了高效表达。这些发现不仅为理解角质酶的催化机制提供了新的视角，也为开发新的生物降解技术提供了科学依据。未来的研究可以进一步优化这些酶的表达系统，探索其在不同应用场景中的潜力，为解决农业和塑料废弃物问题提供可持续的解决方案。