单细胞代谢组学与单植物细胞上的RNA-seq多重检测技术

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Single-cell metabolome and RNA-seq multiplexing on single plant cells

植物通过复杂生物合成途径产生大量天然产物，本研究利用单细胞转录组测序（scRNA-seq）和单细胞质谱代谢组学（scMS）技术，首次实现了对同一植物原质体同时进行基因表达和代谢物浓度分析，揭示了基因表达与代谢物积累的直接关联。通过分析罗望子（Catharanthus roseus）叶片原质体，发现不同细胞类型（表皮细胞、分泌细胞等）中特定代谢物（如secologanin、anhydrovinblastine）的分布模式与已知基因表达标记高度一致，并鉴定出关键转运蛋白NPF2.4的生理作用。该整合方法为解析植物代谢物合成与运输机制提供了新工具。

　　植物在生命活动中能够合成多种具有重要价值的代谢产物，这些化合物广泛应用于医药、农业和营养等领域。随着生物技术的发展，科学家们越来越关注这些化合物的生物合成途径，并致力于揭示其背后的基因调控机制。传统的研究方法通常依赖于组织水平的分析，无法准确反映细胞间的异质性以及代谢产物与基因表达之间的直接关系。近年来，单细胞组学技术的兴起为这一领域带来了革命性的进展，使得在单细胞层面同时测量基因表达和代谢产物浓度成为可能。本文探讨了一种创新的单细胞多组学分析方法，将单细胞转录组学（scRNA-seq）与单细胞代谢组学（scMS）结合，实现了对植物细胞中基因表达和代谢产物浓度的直接关联分析，从而更深入地理解植物代谢产物的合成与运输机制。

单细胞转录组学技术通过高通量测序手段，能够以极高的分辨率捕捉到单个细胞中的基因表达情况。对于植物而言，这种技术特别适用于研究那些仅在特定细胞类型中表达的生物合成基因。例如，许多植物中的次生代谢产物合成基因主要集中在少数几种细胞类型中，如表皮细胞、腺细胞（idioblasts）以及内部韧皮部相关薄壁细胞（IPAP cells）。因此，单细胞转录组学为识别这些基因提供了强有力的工具。然而，单独使用基因表达数据仍难以明确这些基因与代谢产物之间的直接联系。为了弥补这一缺陷，单细胞代谢组学技术被引入，它利用高分辨率质谱仪对单个细胞中的代谢产物进行定量分析。然而，这两种方法在以往的研究中通常是分开进行的，导致无法在单细胞层面建立基因与代谢产物之间的直接关联。

本文的研究重点在于整合这两种技术，实现对同一植物细胞的基因表达和代谢产物浓度的同步测量。通过这种方法，科学家能够构建匹配的基因-代谢产物数据集，从而在单细胞分辨率下进行严格的关联分析。研究团队以一种具有重要药用价值的植物——长春花（*Catharanthus roseus*）为模型，验证了这一方法的可行性。他们利用微流控技术将植物原生质体（protoplasts）分选到96孔板中，并在相同细胞中同时进行RNA测序和代谢组学分析。这一过程的关键在于确保两种技术的兼容性，例如在细胞裂解时，选择合适的条件以同时保留RNA和代谢产物的完整性。

通过这种整合方法，研究团队能够观察到多种代谢产物在不同细胞类型中的分布情况。例如，他们发现某些代谢产物如secologanin和vindoline主要富集在腺细胞中，而其他代谢产物如loganic acid则可能在不同的细胞类型中储存。这种观察为理解植物代谢产物的合成、运输和储存提供了新的视角。此外，研究还发现，某些代谢产物的浓度与特定基因的表达水平之间存在显著的正相关关系，这表明这些基因可能直接参与了代谢产物的合成或调控。例如，vindoline的浓度与*D4H*、*DAT*和*NMT*等基因的表达水平高度相关，这些基因被认为是vindoline生物合成路径中的关键基因。这一发现不仅有助于识别新的生物合成基因，也为理解代谢产物的生物合成机制提供了重要的线索。

然而，研究也揭示了一些有趣的生物学现象。例如，某些代谢产物如catharanthine虽然在表皮细胞中合成，但它们的浓度与这些细胞中的基因表达水平并无显著相关性。这可能意味着这些代谢产物在细胞内经历了复杂的运输过程，或者它们的生物合成受到其他调控机制的影响。此外，研究团队还发现，某些代谢产物如loganic acid的浓度与特定基因的表达水平之间缺乏直接联系，这可能表明loganic acid在细胞内的储存或运输涉及未被识别的细胞类型或机制。这些发现不仅挑战了现有的假设，也为未来的研究提供了新的方向。

为了进一步验证这些发现，研究团队还对细胞中的转运蛋白进行了分析。他们发现，某些已知的转运蛋白基因，如*NPF2.4*、*NPF2.5*和*NPF2.6*，在loganic acid、loganin和secologanin的积累中表现出高度相关性。这表明这些转运蛋白可能在这些代谢产物的跨细胞运输中发挥重要作用。此外，研究还发现，某些转运蛋白的表达可能受到特定细胞类型中代谢产物浓度的影响，这种动态变化为理解细胞间代谢产物的传递机制提供了新的证据。

值得注意的是，研究团队在整合基因表达和代谢产物数据时，采用了多种分析方法。例如，他们使用了UMAP（统一的曼纳多约投影）算法对细胞进行聚类分析，并结合代谢产物的分布情况对细胞类型进行注释。这种整合方法不仅提高了数据的解析能力，还揭示了不同细胞类型之间的代谢产物分布差异。例如，在表皮细胞中，某些代谢产物如secologanin和mauritianin可能存在于不同的亚群中，这表明表皮细胞可能具有不同的代谢功能。这种发现为研究植物细胞的异质性提供了新的思路。

此外，研究还探讨了不同细胞类型之间的代谢产物运输机制。例如，loganic acid的合成发生在IPAP细胞中，随后被运输到表皮细胞中进行进一步转化。然而，loganic acid的浓度并未与IPAP细胞或表皮细胞中的特定基因表达水平显著相关，这可能意味着其运输过程涉及其他未被识别的细胞类型或机制。这一现象提示，尽管基因表达数据能够提供重要的信息，但代谢产物的运输和储存可能受到多种因素的影响，包括细胞间的相互作用、细胞膜的通透性以及特定的运输蛋白。

研究团队还发现，某些代谢产物的浓度与特定基因的表达水平之间存在非线性关系。例如，随着碱类化合物浓度的升高，其对应的生物合成基因的表达水平也会增加，但当浓度达到一定阈值后，基因表达水平反而开始下降。这种现象可能反映了细胞在不同发育阶段的代谢状态变化，或者某些代谢产物可能通过反馈机制抑制了相关基因的表达。这种复杂的调控网络为理解植物代谢产物的动态变化提供了新的视角。

本文的研究方法不仅在技术上具有创新性，还为未来的植物代谢研究提供了重要的参考价值。通过将单细胞转录组学与代谢组学相结合，研究团队能够更全面地解析植物代谢产物的合成、运输和储存机制。这种方法的优势在于，它能够在单细胞层面提供基因表达和代谢产物浓度的同步数据，从而避免了传统方法中由于数据来源不同而导致的间接关联问题。此外，这种方法还能够揭示细胞间的代谢异质性，帮助科学家更准确地识别特定细胞类型的功能。

尽管这种方法在技术上具有诸多优势，但它也存在一些局限性。例如，原生质体的提取过程可能会对细胞的生理状态产生一定影响，从而导致基因表达和代谢产物浓度的变化。此外，由于单细胞代谢组学的分析流程较为复杂，其通量相对较低，这可能会导致某些稀有细胞类型被遗漏。因此，研究团队建议未来的研究可以结合空间转录组学和代谢组学技术，以进一步解析代谢产物在植物组织中的空间分布情况。

总的来说，本文的研究为理解植物代谢产物的生物合成机制提供了重要的工具和方法。通过同时测量基因表达和代谢产物浓度，研究团队能够揭示两者之间的直接关系，并为识别新的生物合成基因和转运蛋白提供了新的思路。这一研究不仅有助于提高对植物代谢网络的理解，还可能加速新型药物分子的发现和开发。未来的研究可以进一步优化这种方法，提高其通量和灵敏度，以更全面地解析植物代谢产物的复杂网络。