一种用于多重筛选真菌GPCR-配体相互作用的酵母交配平台

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：A yeast mating platform for multiplex screening of fungal GPCR–ligand interactions

本文构建了酵母配对平台（YeMaP）用于高通量筛选真菌G蛋白偶联受体（GPCR）与信息素的相互作用，发现合成肽agonist 4（A4）和antagonist Cm可调控植物病原菌F. oxysporum的菌丝趋化及根穿透，为农业抗真菌策略提供新工具。

　　### 真菌信号感知与细胞间通信

真菌在生态系统中扮演着重要角色，不仅参与碳、氮和磷等关键物质的循环，还对植物和动物的生存至关重要。然而，一些植物病原真菌正对全球粮食安全构成日益严重的威胁。随着气候变化的加剧，模拟预测显示植物病害的压力可能会在未来显著上升。为了应对这些挑战，我们需要深入了解真菌群体内部和外部的细胞间通信机制。

G蛋白偶联受体（GPCRs）是真菌感知环境信号的关键分子，它们能够将外部化学信号转化为细胞内的协调反应。这些受体不仅检测真菌的化学信号，如信息素、营养物质、离子、疏水表面或光信号，还参与调控真菌的发育、代谢和致病性。然而，目前我们对真菌GPCR功能的理解仍较为有限，且其与潜在配体之间的相互作用机制尚不清晰，这在一定程度上阻碍了新型抗真菌药物和可持续农业害虫管理策略的开发。

### 建立酵母交配平台用于研究真菌GPCR-信息素相互作用

为了解决这一问题，我们开发了一种酵母交配平台（YeMaP），用于分析真菌GPCR与信息素变体之间的相互作用。该平台通过模拟酵母的自然交配过程，使我们能够研究多种真菌GPCR与信息素之间的交互关系。我们首先以酵母的Ste2受体和信息素为基础，设计了“一对一”（One-on-One）实验，以评估不同交配型酵母细胞之间的相互作用。通过比较不同交配型细胞中Ste2受体和信息素的表达，我们发现当将天然酵母的Ste3受体替换为异源的Ste2受体时，交配频率显著提高。具体而言，对于Candida albicans（Ca）的GPCR-信息素对，这种设置使交配频率比相反组合增加了33倍，这一结果与之前的研究一致。

为了进一步验证该平台的可行性，我们设计了一个“一对一”交配矩阵，其中每种酵母细胞分别表达不同的真菌GPCR和信息素。结果显示，物种特异性信息素-GPCR对具有最高的交配频率，但我们也观察到某些真菌GPCR表现出对其他物种信息素的非特异性响应，例如Beauveria bassiana（Bb）的Ste2受体对Fusarium oxysporum（Fo）的信息素表现出交叉反应性。这一发现表明，酵母交配平台能够有效识别真菌GPCR与信息素之间的特异性及非特异性相互作用。

### 高通量筛选信息素变体以识别增强的激动剂

为了探索酵母交配平台在识别信息素激动剂方面的潜力，我们构建了一个包含8,000个信息素变体的DNA编码库（YPL1），这些变体基于Fo信息素的序列WCXXXGQPCW，其中X代表任何可能的氨基酸，而Gly6-Gln7两个关键残基被保留以维持信息素的三维结构。通过将该信息素库与表达不同GPCR的酵母细胞进行共培养，我们能够通过高通量筛选找到对特定GPCR具有更高亲和力的信息素变体。

经过筛选，我们发现Fo信息素在所有四种GPCR（Bb、Fg、Fo、Bc）中都表现出最强的富集效果。在Bb.Ste2的共培养中，Fo信息素的半数有效浓度（EC50）比Bb信息素低了3,910倍，这表明Fo信息素对Bb.Ste2具有更强的激活能力。此外，我们还发现了两个具有较高活性的合成激动剂A4和A5，它们对Fo.Ste2的EC50值分别比天然Fo信息素低了13倍和至少57倍。这一发现为开发更高效的抗真菌策略提供了重要的线索。

### 外部因素如何影响信息素-GPCR网络

为了研究外部环境因素对真菌信息素-GPCR网络的影响，我们设计了“库对库”（Library-on-Library）实验。我们引入了一个基于Cre-lox重组酶的条形码系统，以检测不同酵母菌株之间的交配事件。通过这一系统，我们能够对不同交配型菌株之间的相互作用进行量化分析，并评估不同环境条件（如pH值、氮源、植物过氧化物酶等）对这些相互作用的影响。

实验结果显示，Fo信息素-GPCR系统在所有测试条件下都表现出最大的交配频率，这表明该系统具有较高的鲁棒性。相比之下，Fg信息素-GPCR系统在含有HRP（过氧化物酶）的培养基中表现出显著的交配频率下降。这一结果可能与HRP对Fo信息素-GPCR系统的影响有关，因为HRP已被证明能够通过Fo.Ste2受体诱导菌丝的化学趋化性。

### 外部信息素补充如何改变植物病原真菌的细胞间通信

为了进一步探讨外部信息素补充对植物病原真菌细胞间通信的影响，我们测试了不同信息素（如Cm、A4和随机肽）对真菌网络的影响。在SC培养基中，当不添加外部信息素或仅添加随机肽时，几乎所有交配事件都发生在Fo.Ste2与Fo信息素之间。然而，当添加Cm信息素时，Fo.Ste2的交配频率显著下降，而Fg.Ste2的交配频率则显著上升。这表明Cm信息素可能作为Fo.Ste2的拮抗剂，抑制其与Fo信息素的相互作用。

同样，A4信息素的添加显著增加了Bb.Ste2和Hj.Hpr2的交配频率，同时对Fo.Ste2的交配频率产生抑制作用。这一结果表明，A4信息素可能在促进某些非致病性真菌的交配行为方面具有重要作用。我们还发现，氮源（如尿素）对交配频率具有显著影响，SC培养基中添加尿素后，Bb.Ste2和Hj.Hpr2的交配频率分别增加了4倍和20倍。

### 酵母交配平台在植物病原真菌中的应用验证

为了验证酵母交配平台在实际植物病原真菌中的应用效果，我们测试了外部信息素对F. oxysporum（Fo）菌丝趋化性的影响。结果表明，Fo信息素和A4信息素均能显著诱导Fo菌丝的趋化性，而Bb信息素和随机肽则没有这种效果。此外，当Fo菌丝同时暴露于竞争性趋化性梯度（如Fo信息素和A4信息素）时，A4信息素能够完全抑制Fo信息素的趋化作用，而Bb信息素只能部分抑制。

这些结果表明，酵母交配平台不仅能够有效识别信息素与GPCR之间的相互作用，还能在实际植物病原真菌中验证其功能。此外，我们还发现，外部信息素的添加能够显著减少Fo菌丝在番茄根部的侵入，但并未对植物存活率产生显著影响。这可能与信息素的浓度、作用时间以及稳定性有关，未来需要进一步优化这些参数以提高其抗真菌效果。

### 未来展望与应用潜力

酵母交配平台（YeMaP）为研究真菌细胞间通信提供了一种强大的工具，不仅能够高通量筛选信息素变体，还能评估不同环境因素对这些相互作用的影响。通过这一平台，我们发现Fo信息素-GPCR系统在多种环境条件下表现出较强的鲁棒性，这可能与其在植物感染过程中主动调节pH值和增强根部定殖能力有关。

未来，我们计划利用YeMaP研究不同土壤成分和肥料对真菌群体间通信的影响，并开发针对病原真菌的合成分子，以干扰其自然的细胞间通信能力。这不仅有助于理解真菌的生态行为，还可能为农业抗真菌策略提供新的思路和方法。此外，我们还计划进一步研究信息素-GPCR信号在非致病性真菌（如Bb）中的作用，以探索其在生物防治中的潜在价值。

总之，酵母交配平台的建立为研究真菌GPCR-信息素相互作用提供了新的方法，不仅能够提高研究效率，还能揭示真菌在复杂环境中的行为模式。通过这一平台，我们有望在未来的农业和生态研究中，找到更有效的抗真菌策略，并推动相关领域的进一步发展。