Collectin-11对糖链的识别促进了SARS-CoV-2的感染性以及呼吸道上皮细胞的膜损伤

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Glycan recognition by collectin-11 drives SARS-CoV-2 infectivity and membrane injury of respiratory epithelial cells

CL-11通过糖基结合激活补体，但SARS-CoV-2通过逃逸补体裂解和增强感染性机制维持呼吸道感染。研究发现CL-11与病毒刺突蛋白结合，促进细胞内病毒复制，同时诱导宿主细胞自身补体系统激活导致膜损伤。L-岩藻糖可阻断CL-11与病毒及细胞表面的糖基结合，提示CL-11是病毒在呼吸道上皮细胞内扩散的关键宿主因子，为抗病毒治疗提供新靶点。

　　SARS-CoV-2，即导致2019年新冠疫情的病毒，虽然疫苗显著降低了严重感染和住院风险，但其在呼吸道中的感染仍无法完全避免。这一现象提示我们，除了适应性免疫反应之外，还存在其他因素在维持病毒在呼吸道中的感染和传播中发挥了关键作用。本文探讨了这些因素之一——collectin-11（CL-11）在SARS-CoV-2感染过程中的作用。CL-11是一种由上皮细胞广泛分泌的糖结合蛋白，它在先天免疫中扮演着重要角色，通过激活补体系统来清除病原体。尽管SARS-CoV-2能够与CL-11结合并触发补体激活，但它对补体介导的裂解具有抵抗力，这为其免疫逃逸提供了可能的机制。此外，研究还发现CL-11的结合能够增强SARS-CoV-2在呼吸道上皮细胞（RECs）中的感染能力，这一增强机制不依赖于补体系统，从而为高度传染性的SARS-CoV-2变种提供了生存优势。同时，感染的RECs容易受到自身产生的CL-11和补体引起的膜损伤。这些发现为通过阻断CL-11来减少SARS-CoV-2在呼吸道中的感染和损伤提供了坚实的理论依据。

SARS-CoV-2与CL-11的相互作用首先通过结合实验得到了验证。研究团队利用重组CL-11（rCL-11）蛋白，结合SARS-CoV-2病毒颗粒和其刺突蛋白，发现rCL-11能够以与病毒颗粒或刺突蛋白浓度成正比的方式结合。在使用非糖基化的蛋白质作为对照时，结合量几乎可以忽略不计。进一步的流式细胞术实验表明，rCL-11能够显著结合表达细胞表面刺突蛋白的HEK293T细胞，而未表达刺突蛋白的细胞则没有这种结合现象。这些数据强有力地证明了CL-11能够与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，特别是在病毒颗粒被固定在塑料表面或细胞表面表达时。

为了进一步理解CL-11如何通过其糖结合域（CRD）与SARS-CoV-2刺突蛋白相互作用，研究团队分析了CL-11的晶体结构，发现L-岩藻糖能够有效阻断这种结合。在实验中，当使用L-岩藻糖处理rCL-11后，其对SARS-CoV-2刺突蛋白的结合能力被显著抑制。而D-葡萄糖和D-甘露糖的阻断效果则相对较弱，这表明L-岩藻糖对CL-11的结合具有更高的特异性。通过结构分析，研究团队还发现，L-岩藻糖能够占据CL-11 CRD的两个结合位点，其中一个是与钙离子（Ca2?）直接结合的主位点，另一个则是在相邻的亚位点中形成氢键并与其他氨基酸残基相互作用。这一结构特征解释了为什么L-岩藻糖能够高效地阻断CL-11的糖识别功能，从而抑制其对SARS-CoV-2的结合。

接下来，研究团队探讨了SARS-CoV-2是否能够触发补体系统的激活。通过使用正常人血清（NHS）作为补体来源，他们检测了SARS-CoV-2在激活补体后释放的C3a和C5a等可溶性补体激活产物。实验结果表明，SARS-CoV-2能够显著诱导这些补体产物的生成，说明其确实能够激活补体系统。此外，当SARS-CoV-2与NHS共同培养时，检测到C3d和C5b-9（膜攻击复合物）的沉积，进一步支持了补体激活的假设。然而，值得注意的是，尽管SARS-CoV-2能够激活补体系统，但它对补体介导的裂解具有抵抗力。这一发现意味着，虽然病毒能够触发补体反应，但其自身的结构可能使其免于被补体系统破坏。

为了验证SARS-CoV-2对补体介导裂解的抵抗性，研究团队进行了病毒裂解实验。他们将SARS-CoV-2与不同浓度的NHS或热灭活血清（HI NHS）共同培养，并使用RNase A检测病毒是否被裂解。结果显示，即使在较高浓度的NHS或HI NHS处理下，病毒的裂解程度并未显著增加，这表明SARS-CoV-2对补体裂解具有较强的抵抗能力。此外，当NHS中补充了rCL-11后，病毒裂解情况与未补充的NHS无明显差异，进一步说明CL-11对病毒裂解的影响有限。

然而，研究团队发现，尽管SARS-CoV-2能够抵抗补体裂解，但CL-11的结合却显著增强了其在呼吸道上皮细胞中的感染能力。通过将SARS-CoV-2病毒颗粒与不同浓度的rCL-11预处理后，再与呼吸道上皮细胞共培养，发现感染滴度显著增加，尤其是在较高浓度的rCL-11处理下。这一增强效应与补体系统的存在无关，而是通过CL-11的糖识别机制实现的。进一步的实验表明，L-岩藻糖能够有效阻断这一增强效应，这与CL-11的糖识别域被占据的机制一致。

研究还发现，SARS-CoV-2感染的呼吸道上皮细胞会表现出对自身产生的CL-11和补体的敏感性。通过使用共聚焦显微镜观察，研究团队发现，感染的细胞不仅表现出CL-11和补体成分（如C3d和C5b-9）的沉积，而且这些沉积区域与病毒刺突蛋白的表达区域有部分重叠。这表明，CL-11不仅通过其糖识别域与病毒结合，还可能通过与细胞表面的糖基化结构相互作用，导致细胞膜损伤。这一发现为理解SARS-CoV-2感染如何导致细胞损伤提供了新的视角。

在探讨CL-11在SARS-CoV-2感染中的作用时，研究团队还考虑了不同病毒变种的感染能力。例如，Delta变种（B.1.617.2）在被rCL-11处理后，其在呼吸道上皮细胞中的感染能力显著增强，这可能与该变种在糖基化方面的特性有关。此外，研究团队还使用了来自健康捐赠者的原代呼吸道上皮细胞（HBECs）进行实验，以模拟人体内的感染环境。结果显示，与rCL-11结合的SARS-CoV-2在这些细胞中的感染滴度显著增加，进一步支持了CL-11在病毒传播中的作用。

研究还指出，CL-11的多价结构可能在病毒与上皮细胞之间的相互作用中发挥了重要作用。这种多价结构能够通过与病毒和宿主细胞表面的糖基结构结合，促进病毒与细胞的交叉链接，从而可能增强病毒的内吞作用或加工过程。这一特性可能对于某些SARS-CoV-2变种，特别是那些与ACE2受体结合能力较低的变种，具有特别重要的意义。因为这些变种可能需要通过CL-11的这种机制来增强其在呼吸道上皮细胞中的感染能力。

此外，研究团队还探讨了CL-11在SARS-CoV-2感染中可能的病理作用。他们发现，感染的呼吸道上皮细胞不仅表现出CL-11和补体成分的沉积，还显示出膜攻击复合物（MAC）的形成。这种MAC的形成可能导致细胞膜的损伤，进而引发炎症反应和组织损伤。这一发现为理解SARS-CoV-2感染如何导致呼吸道损伤提供了新的机制。

研究还指出，CL-11的结合不仅影响病毒的感染能力，还可能通过激活补体系统促进炎症反应。这种炎症反应可能在病毒感染后的恢复期未能完全消退，从而导致长期的免疫反应，如Long COVID所表现出的症状。因此，CL-11可能在SARS-CoV-2感染的持续性和传播性中发挥了双重作用：一方面，它通过增强病毒的感染能力促进病毒在宿主细胞中的复制；另一方面，它通过激活补体系统引发炎症反应，进而导致组织损伤。

基于这些发现，研究团队提出了一个可能的治疗策略：通过阻断CL-11与病毒和宿主细胞表面的糖基结构的结合，来减少SARS-CoV-2在呼吸道中的感染和传播。他们发现，L-岩藻糖能够有效阻断CL-11的结合，从而抑制其对病毒的增强作用。这一发现为开发针对CL-11的抗病毒疗法提供了理论基础。此外，研究团队还提到，L-岩藻糖在小鼠和人体实验中已被证明是安全且有效的，这为临床应用提供了可能性。

综上所述，本文的研究揭示了CL-11在SARS-CoV-2感染中的双重作用：一方面，它通过与病毒结合并触发补体激活，促进病毒的感染能力；另一方面，它对补体介导的裂解具有抵抗力，这可能有助于病毒在宿主体内存活并传播。这些发现不仅加深了我们对SARS-CoV-2免疫逃逸机制的理解，也为开发新的抗病毒策略提供了新的思路。