靶向PARP1/HPF1/SMARCA1轴调控ABC转运蛋白克服三阴性乳腺癌多药耐药性的新机制

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：GB10, a novel antibody fusion protein targeting VEGF/Ang-2, exhibits promising therapeutic efficacy for neovascular eye diseases

本研究针对化疗中多药耐药（MDR）这一关键难题，深入探讨了PARP1/HPF1复合物通过表观遗传调控ABC转运蛋白表达的新机制。研究人员发现，抑制PARP1或沉默其复合物组分可显著下调ABCC和ABCG2等转运蛋白，增加化疗药物在耐药细胞内的积累。尤为重要的是，该研究首次鉴定出染色质重塑因子SMARCA1是PARP1依赖性ABCC基因调控的关键效应器，为克服三阴性乳腺癌（TNBC）多药耐药性提供了新的潜在治疗靶点和组合策略。

　　

在癌症治疗领域，化疗至今仍是广泛应用的重要手段，但癌细胞产生的多药耐药性（Multidrug Resistance, MDR）常常导致治疗失败和疾病复发，成为临床上面临的一大挑战。其中，ATP结合盒（ATP-binding Cassette, ABC）转运蛋白家族的过度表达是驱动MDR的关键机制之一。这些位于细胞膜上的“分子泵”能够利用水解ATP产生的能量，将多种结构各异的化疗药物主动排出细胞外或隔离在细胞内特定区室，从而显著降低药物的细胞内浓度和治疗效果。尽管科学家们对ABC转运蛋白的认识不断深入，但调控其过度表达的精确分子机制，尤其是在特定癌症如三阴性乳腺癌（Triple-Negative Breast Cancer, TNBC）中，仍有大量未知亟待探索。

先前的研究表明，由BRG1和p300组成的转录激活复合物存在于某些ABC转运蛋白基因的启动子区域，提示表观遗传调控可能在其中扮演重要角色。p300是一种重要的组蛋白乙酰转移酶，其活性可以通过ADP-核糖基化（ADP-ribosylation）进行修饰。而聚（ADP-核糖）聚合酶1（Poly(ADP-ribose) Polymerase 1, PARP1）正是催化这种修饰的关键酶之一。PARP1家族成员在DNA损伤修复、转录调控和代谢等多种细胞过程中发挥核心作用。尤其引人注目的是，当组蛋白PAR化因子1（Histone PARylation Factor 1, HPF1, 也称为C4orf27）被招募至DNA损伤位点时，会改变PARP1的底物特异性，使其主要对丝氨酸残基进行ADP-核糖基化。这促使研究人员思考：PARP1/HPF1复合物是否参与了在化疗压力下ABC转运蛋白基因的转录调控？其背后的具体分子通路又是怎样的？为了回答这些问题，来自波兰罗兹大学的研究团队在《Biomedicine 》上发表了他们的最新研究成果。

为了深入探究上述问题，研究人员主要运用了几项关键技术：他们使用了基础型和阿霉素诱导耐药的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系作为模型。通过PARP1抑制剂（如Veliparib和Olaparib）处理或利用小干扰RNA（siRNA）技术特异性沉默PARP1和HPF1基因，来观察ABC转运蛋白表达和药物积累的变化。染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）和生物信息学分析被用于在全基因组范围内寻找与PARP1结合的DNA区域，并鉴定参与调控的关键转录因子。此外，共免疫沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）技术用于验证PARP1、HPF1、p300以及SMARCA1蛋白之间的物理相互作用。实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）和蛋白质印迹（Western Blot）分别用于在mRNA和蛋白质水平上检测基因表达的变化。共聚焦显微镜（Confocal Microscopy）则被用来直观地观察ABC转运蛋白的亚细胞定位以及化疗药物（如具有自发荧光的阿霉素）在细胞内的积累情况。

3. 结果

3.1 PARP1抑制下调ABC转运蛋白表达并增强药物积累

研究首先证实，在野生型MDA-MB-231细胞中，使用PARP1抑制剂Olaparib和Veliparib处理72小时后，多种ABCC家族转运蛋白（如ABCC1, ABCC2, ABCC3, ABCC4）的mRNA和蛋白水平均出现显著下调。功能上，PARP1抑制显著增加了 daunorubicin 和 methotrexate 等化疗药物在细胞内的积累。在阿霉素耐药的MDA-MB-231细胞中，这种抑制效果更为广泛，除了ABCC家族成员外，ABCG2的表达也受到明显抑制，并且对 methotrexate, paclitaxel 和 daunorubicin 的积累增强效应更为显著。细胞毒性测试排除了PARP1抑制剂本身非特异性细胞应激的影响，表明观察到的效应是特异性的。

3.2 PARP1/HPF1复合物的沉默在耐药细胞中特异性下调ABC转运蛋白

为了确认PARP1的作用并探讨其伙伴蛋白HPF1的功能，研究人员进行了基因沉默实验。在野生型细胞中，沉默PARP1能下调部分ABCC基因，而沉默HPF1仅对ABCC1有显著影响。然而，在本身就存在DNA损伤背景的阿霉素耐药细胞中，沉默PARP1或HPF1均能导致所有被测ABC转运蛋白基因的表达下降。共聚焦显微镜观察进一步证实，在耐药细胞的2D和3D培养模型中，沉默PARP1或HPF1能显著增加抗癌药物在细胞内的积累，而在野生型细胞中此效应不明显。这提示PARP1/HPF1复合物对ABC转运蛋白的调控是应激依赖性的。

3.3 PARP1/HPF1复合物形成依赖于基因毒性应激且其效应可被抗氧化剂逆转

通过共免疫沉淀实验，研究人员证实了PARP1和HPF1之间存在直接的物理相互作用，并且这种复合物的形成在细胞暴露于H₂O₂或etoposide等DNA损伤剂后增强。在阿霉素耐药细胞中，PARP1和HPF1在细胞核内存在明显的共定位，且ADP-核糖基化水平显著高于野生型细胞，表明耐药细胞中存在更高的PARP1活性和DNA损伤水平。有趣的是，当使用抗氧化剂如谷胱甘肽（Glutathione, GSH）或维生素C（Vitamin C）处理细胞时，Veliparib对关键耐药基因ABCC3, ABCC4和ABCC5的转录抑制效应被部分逆转。这表明氧化应激（Reactive Oxygen Species, ROS）环境是PARP1/HPF1复合物发挥调控功能的重要条件。检测证实，耐药细胞内的ROS水平确实高于野生型细胞。

3.4 耐药细胞中PARP1蛋白的翻译后修饰水平升高

研究人员探索了除DNA损伤外，可能影响PARP1活性的细胞内机制。他们发现，与野生型细胞相比，阿霉素耐药细胞中的PARP1蛋白的乙酰化、甲基化和磷酸化等翻译后修饰（Post-Translational Modifications, PTMs）水平均有所升高。已知某些特定的PTMs能够调节PARP1的酶活性，这些修饰的变化可能也是导致耐药细胞中PARP1功能亢进的因素之一。

3.5 鉴定SMARCA1为PARP1依赖性ABCC基因调控的关键因子

通过ChIP-Seq分析，研究人员绘制了PARP1在基因组上的结合图谱，发现PARP1富集于多个ABC转运蛋白基因（如ABCC3, ABCC4, ABCC5, ABCC10）转录起始位点（Transcription Start Site, TSS）附近±170 kb的区域内。随后，利用生物信息学工具对PARP1富集区域的DNA序列进行模体（Motif）分析，旨在寻找可能协同PARP1调控基因表达的转录因子。分析结果将目标锁定在三个候选因子：p53, p73 和 SMARCA1。其中，SMARCA1（SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily A member 1）属于ISWI（Imitation Switch）家族的染色质重塑蛋白，引起了研究人员的特别关注。功能验证实验显示，在阿霉素耐药细胞中沉默SMARCA1，可显著下调ABCC2, ABCC3和ABCC4的表达，但却意外地上调了ABCC5的表达，表明SMARCA1对不同ABC转运蛋白基因的调控具有双向性（既可激活也可抑制）。更重要的是，沉默SMARCA1能显著增强耐药细胞对阿霉素和紫杉醇的敏感性，并增加这些药物在细胞内的积累。共免疫沉淀实验最终证实，在耐药细胞中，PARP1, HPF1, p300和SMARCA1形成了一个物理上相互作用的复合物。ChIP-qPCR也验证了SMARCA1确实结合在ABCC3, ABCC4和ABCC5基因的PARP1富集区域。

4. 讨论与结论

本研究系统地阐明了一个由PARP1/HPF1/p300/SMARCA1组成的多蛋白复合物在调控三阴性乳腺癌多药耐药性中的核心作用。该复合物在基因毒性应激（如化疗药物处理）条件下被激活，通过染色质重塑和转录调控机制，促进特定ABC转运蛋白（尤其是ABCC3和ABCC4）的过度表达，从而增强癌细胞的药物外排能力，导致化疗失败。研究人员首次将染色质重塑因子SMARCA1确定为该通路中的关键效应器，揭示了其在不同ABC基因表达中的特异性调控功能（激活ABCC2/3/4，抑制ABCC5）。此外，研究还发现常用的抗氧化剂能够影响这一调控通路，提示氧化应激微环境的重要性。

这项研究的发现具有重要的理论和临床意义。在理论层面，它深化了我们对多药耐药表观遗传调控机制的理解，将DNA损伤应答（PARP1/HPF1）、组蛋白修饰（p300）和染色质重塑（SMARCA1）等多个重要生物学过程联系起来，形成了一个相对完整的调控网络。在临床转化层面，该研究为克服TNBC的多药耐药性提供了新的潜在策略。除了直接应用PARP1抑制剂（部分已获批临床使用）外，靶向SMARCA1或其与PARP1的相互作用，可能成为未来联合疗法的新方向。这种表观遗传靶向疗法与常规化疗的结合，有望在降低化疗药物剂量、减少毒副作用的同时，有效逆转耐药性，改善难治性乳腺癌患者的预后。当然，这一机制的普适性需要在其他癌症模型和体内环境中进一步验证，其靶向治疗的安全性和有效性也亟待后续的临床前和临床研究进行评估。