酿酒酵母甲酸耐受性机制解析：SAT4基因在分子模型中的关键作用及工业应用潜力

本研究针对酿酒酵母在木质纤维素生物乙醇生产中面临甲酸抑制的关键问题，通过比较转录组和代谢组学分析，揭示了甲酸耐受菌株YI30和CESPLG05通过上调SAT4（调控TRK1钾/甲酸转运蛋白）和FDH1（甲酸脱氢酶）基因、重塑甘油代谢（GPD2/GPP2）及细胞壁完整性通路来增强耐受性的分子机制。该研究为构建高效甲酸耐受型工业酵母菌株提供了重要靶点和理论模型，对推动第二代生物乙醇产业发展具有重要意义。

　　

在追求绿色可持续能源的道路上，第二代生物乙醇因其原料来源广泛（如农业废弃物、林业残余物等）而备受关注。然而，利用木质纤维素原料生产乙醇面临一个重大挑战：预处理过程中会释放出多种抑制微生物生长的毒性化合物，其中甲酸（Formic acid）被认为是对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）生长和发酵影响最显著的弱酸之一。在有些水解液中，甲酸浓度甚至可高达15 g/L。高浓度甲酸会引发细胞氧化损伤、破坏膜运输、干扰细胞周期并导致凋亡样细胞死亡，严重制约了生物乙醇的生产效率。尽管人们对乙酸等弱酸的作用机制已有较多了解，但酿酒酵母对甲酸胁迫的响应机制，尤其是在接近工业实际的发酵条件下，仍然知之甚少。此前的研究多局限于单一菌株在丰富培养基中的反应，缺乏对不同耐受性菌株在模拟工业条件下系统性反应的深入探索。

为了填补这一空白，发表在《Bioresource Technology》上的这项研究，由意大利帕多瓦大学的研究团队领衔，旨在深入揭示酿酒酵母应对甲酸胁迫的分子机制。研究人员选取了三株具有不同甲酸耐受性的酿酒酵母菌株——两株耐受菌株（YI30和CESPLG05）和一株敏感菌株（DSM 70449），在含有50 g/L葡萄糖和4.0 g/L甲酸（pH 4.5）的合成葡萄汁培养基中进行了发酵实验。这种培养基模拟了第二代生物乙醇生产的实际环境。研究团队通过监测发酵过程中的二氧化碳释放来评估发酵速率，并利用高效液相色谱（HPLC）分析了葡萄糖消耗以及乙醇、甘油、乙酸、甲酸等代谢产物的浓度。尤为关键的是，他们在发酵的中期稳定期（T1）和晚期稳定期（T2）两个时间点采集样本，进行了RNA测序（RNA-seq）分析，以获取菌株在应对甲酸胁迫过程中基因表达的动态变化。通过生物信息学方法，包括差异表达基因（DEGs）分析、基因本体（GO）富集分析、KEGG通路富集分析以及转录因子调控网络预测（使用YEASTRACT数据库），系统性地描绘了耐受菌株与敏感菌株在转录水平和代谢水平上的差异。

3.1. 甲酸存在下的发酵研究：初步表型和转录组学见解

发酵曲线显示，甲酸显著延迟了敏感菌株DSM 70449的生长，而两株耐受菌株的生长未受明显影响。代谢产物分析表明，耐受菌株YI30和CESPLG05在4.0 g/L甲酸存在下，最终乙醇产量分别达到理论值的93%和89%，显著高于敏感菌株DSM 70449（84%）。一个关键发现是，在耐受菌株的发酵液中，T2时间点的甲酸浓度较T1有所下降，而敏感菌株的甲酸浓度几乎不变，提示耐受菌株可能存在主动消耗或转化甲酸的机制。转录组分析揭示了菌株间迥异的应答模式：耐受菌株YI30表现出最强烈的转录响应（T2时607个DEGs），而另一耐受菌株CESPLG05的响应则相对精简（T2时388个DEGs）。敏感菌株DSM 70449在T1时转录变化很小（49个DEGs），尽管其生长已受抑制，直到T2时才出现大量基因表达变化（417个DEGs），反映出其适应反应的延迟。

3.2. 富集的GO类别

GO富集分析表明，所有菌株在甲酸胁迫下均发生了代谢适应。耐受菌株YI30的响应涉及“结构分子活性”、“核糖体结构”等类别，提示其可能通过增强蛋白质合成能力来应对胁迫。到了T2时期，其响应更集中于“有机酸代谢过程”和“氧化还原酶活性”，表明代谢调整和氧化还原平衡的重要性。敏感菌株DSM 70449在T2时期仍富集于“跨膜运输”和“对非生物刺激的反应”等类别，显示其持续处于应激状态。耐受菌株CESPLG05的响应则突出了“碳水化合物代谢过程”和“跨膜运输”，体现了其代谢灵活性和转运系统在适应中的关键作用。

3.3. 富集的KEGG通路

KEGG通路富集分析显示，在T2时期，所有菌株都富集了“碳代谢”和“糖酵解/糖异生”通路，表明甲酸胁迫引发了中心碳代谢的重编程。耐受菌株还特异性地富集了“核糖体”、“内质网中的蛋白质加工”、“甲烷代谢”（与一碳化合物代谢相关）、“乙醛酸和二羧酸代谢”等通路，这些通路可能与胁迫下的蛋白质稳态维持、甲酸解毒或同化过程有关。

3.4. 关键基因见解及与甲酸耐受性相关的通路

研究人员深入分析了与甲酸耐受性密切相关的几条关键通路：

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  糖酵解/糖异生：耐受菌株上调了多个己糖转运蛋白基因（如HXT2, HXT3, HXT4, HXT6, HXT7）和糖酵解关键酶基因（如HXK1, HXK2, TPI1, ADH1, ADH6），表明其能维持高效的葡萄糖摄取和糖酵解通量，保障能量供应。而敏感菌株中某些基因（如HXT2, ALD6）表达下调，提示其代谢适应性不足。
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  戊糖磷酸途径（PPP）和谷胱甘肽代谢：PPP通路的上调（如GND2）为细胞提供了重要的还原力NADPH，这对于维持谷胱甘肽（GSH）的还原状态、抵抗氧化应激至关重要。耐受菌株中RNR3（核糖核苷酸还原酶）的上调也有助于在胁迫下维持基因组稳定性。
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  丙酮酸代谢：耐受菌株中ENO1（烯醇化酶）和DAL7（乙醛酸途径相关酶）的上调，与先前甲酸胁迫研究结果一致，可能参与应激反应和氮代谢。
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  脂肪酸代谢和甾醇生物合成：耐受菌株，尤其是CESPLG05，显著上调了多个麦角固醇合成基因（ERG1, ERG3, ERG5, ERG25）。麦角固醇是酵母细胞膜的关键组分，其生物合成的增强有助于维持膜完整性，是抵抗弱酸胁迫的常见策略。
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  甘油代谢：耐受菌株中GPD2（甘油-3-磷酸脱氢酶）和GPP2（甘油-3-磷酸磷酸酶）的上调至关重要。GPD2参与线粒体穿梭以再生NAD⁺，GPP2则直接催化甘油合成。这不仅有助于渗透压调节，还能平衡细胞内的氧化还原状态。代谢数据也显示耐受菌株外部甘油浓度较低，暗示其甘油代谢路径更为精细调控。
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  MAPK信号通路（特别是细胞壁完整性通路CWI）：耐受菌株YI30上调了细胞壁应激传感器基因MTL1和WSC2，CESPLG05则上调了负责细胞壁β-葡聚糖合成的FKS1基因。这表明耐受菌株能够有效感知并修复甲酸可能造成的细胞壁损伤。敏感菌株则缺乏此类通路的显著激活。

3.5. 发酵产物及酿酒酵母中潜在的甲酸抗性机制

基于上述发现，研究团队首次提出了一个酿酒酵母甲酸耐受性的分子模型。该模型的核心在于：甲酸可能通过被动扩散和由SAT4正调控的TRK1钾离子转运蛋白（推测也能转运甲酸根离子）进入细胞。进入细胞后，甲酸被高度上调的甲酸脱氢酶FDH1催化分解为CO₂，同时再生NADH。这一解毒过程是耐受菌株能够降低外部甲酸浓度的关键。此外，细胞通过上调ERG基因增强膜完整性，通过激活CWI通路（MTL1, WSC2, FKS1）强化细胞壁，通过调整甘油代谢（GPD2, GPP2）平衡 redox 状态和渗透压，并通过维持高效的糖酵解和能量代谢来支持生长和乙醇发酵。转录因子Mga1p和Upc2p可能在此调控网络中发挥重要作用，它们既能调控FDH1的表达，也与ERG基因的上调相关。

本研究首次系统地揭示了酿酒酵母在接近工业条件下的甲酸耐受机制，鉴定出SAT4-FDH1-TRK1轴、甘油代谢重编程、细胞壁和膜完整性强化等关键环节。这些发现不仅深化了对酵母应激生物学的理解，更重要的是为通过代谢工程手段构建高甲酸耐受性的工业酵母菌株提供了明确的理论依据和一系列有价值的靶点基因（如SAT4, FDH1, TRK1, GPD2, GPP2, ERG基因簇等）。未来，对这些候选基因进行功能验证和组合优化，将有望显著提升酿酒酵母在木质纤维素生物乙醇生产中的鲁棒性和生产效率，推动第二代生物燃料技术的产业化进程。