利用Mizithra二次乳清生物反应器培养Papiliotrema laurentii生产胞内外多糖的特性及其功能研究

《Carbon Capture Science & Technology》：Production and characterization of cellular and released polysaccharides by Papiliotrema laurentii strains bioreactor-cultivated on Mizithra secondary cheese whey

本刊推荐：为解决乳品工业副产物二次乳清(SCW)污染和高附加值利用问题，研究人员开展了利用Papiliotrema laurentii菌株生物转化SCW生产胞内多糖(cPS)和胞外多糖(EPS)的研究。结果表明，菌株NRRL Y-2536在SCW上高效生产了富含β-葡聚糖(>62%)的生物量(14.8 g/L)和高产量(22.7 g/L)的EPS。cPS和部分EPS显示出对HT29-MTX癌细胞的细胞毒性，而热处理的EPS则无细胞毒性，展现了其在功能食品、化妆品和生物医学领域的应用潜力。该研究为乳清废水的资源化高值利用和功能性多糖的开发提供了新策略。

　　

在追求循环经济和可持续发展的今天，如何将农业食品工业产生的大量副产物“变废为宝”成为了科学家们面临的重大挑战。乳酪制造业就是一个典型的例子，在生产过程中会产生一种名为“二次乳清（Secondary Cheese Whey, SCW）”的副产物。这种液体富含乳糖和含氮化合物，若直接排放会造成严重的环境富营养化污染，但其处理成本高昂，给企业带来了沉重负担。与此同时，微生物多糖，特别是那些由酵母产生的多糖，因其卓越的功能特性（如抗氧化、免疫调节、抗癌潜力）以及在食品、饲料、医药和化妆品行业的广泛应用前景而备受关注。然而，微生物多糖的商业化生产常常受限于高昂的底物成本。能否利用SCW这种低成本、甚至负成本的原料来生产高价值的微生物多糖，从而实现环境效益与经济效益的双赢呢？发表在《Carbon Capture Science & Technology》上的这项研究给出了肯定的答案。

为了开展研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：使用生物反应器进行Papiliotrema laurentii酵母菌的批次培养；通过高速离心、冻干、高压均质、Sevag法去蛋白、乙醇沉淀等技术分离提取胞内多糖(cPS)和胞外多糖(EPS)；利用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)和高效液相色谱(HPLC)分析多糖的结构和单糖组成；采用铁离子还原抗氧化能力(FRAP)测定法评估多糖的抗氧化活性；并通过MTT法检测多糖提取物对两种人源癌细胞系（Caco-2和HT29-MTX）活力的影响。

3.1. P. laurentii Y-2536在SCW上的分批生物反应器培养；酵母脂质谱和酵母生物量中β-葡聚糖含量的测定

研究人员在生物反应器中利用预处理过的SCW培养了P. laurentii NRRL Y-2536菌株。经过45小时的培养，菌株完全同化了SCW中的乳糖（约50 g/L），产生了14.8 g/L的干生物量，其生产效率达到331 mg/L/h。尤为引人注目的是，这些生物量富含胞内多糖(cPS)，含量高达46.2%（重量比），相当于6.9 g/L。同时，培养液变得高度粘稠，原因是菌株向培养基中释放了大量的胞外多糖(EPS)，浓度达到22.7 g/L，生产效率高达504 mg/L/h，这一产量在已知文献报道中处于领先水平。对生物量中脂质的分析显示，脂质含量相对较低（8.1%， w/w），其主要脂肪酸为油酸和棕榈酸。更重要的是，研究人员通过酶学方法测定发现，菌株Y-2536和YB-3594的生物量中β-葡聚糖含量非常丰富，分别占干重的28.3%和24.7%，且占其总cPS的比例均超过62%，而α-葡聚糖的含量极低。

3.2. 多糖富集酵母提取物的表征（FTIR表征、单糖测定、抗氧化能力评估）

本研究成功从两株菌的冻干生物量和培养上清液中分离出了cPS和EPS样品，包括2536-cPS, 3594-cPS, 2536-EPS, 3594-EPS，并对来自Y-2536的EPS进行了热预处理，得到2536-tEPS。通过ATR-FTIR光谱分析发现，所有样品都显示出羧甲基化多糖的特征峰。cPS样品中还检测到与酰胺基团和N-连接乙酰基相关的吸收峰，这可能源于酵母细胞壁结构成分（几丁质/壳聚糖）或残留的蛋白质。主成分分析(PCA)能够根据多糖的来源（菌株）和类别（cPS或EPS）对光谱进行有效区分。单糖组成分析揭示了关键差异：两种菌的cPS均以葡萄糖为主（>62%），证实了β-葡聚糖是其主要成分；而它们的EPS则几乎不含葡萄糖，主要由半乳糖、木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸构成，属于半乳-木-甘露聚糖结构。抗氧化能力(FRAP法)评估显示，3594-cPS的抗氧化活性最高（207.9 μM Trolox当量），显著高于其他样品，而所有EPS样品的抗氧化活性均较低。所有样品中均未检测到硫酸根基团。

3.3. 对人源细胞活力的影响

研究人员进一步评估了这五种多糖样品对两种人结直肠腺癌细胞系（Caco-2和HT29-MTX）活力的影响。MTT实验结果表明，在测试浓度范围（150-600 μg/mL）内，所有样品对Caco-2细胞的活力均未产生统计学上的显著影响。然而，对于HT29-MTX细胞，3594-cPS在300和600 μg/mL浓度下、2536-EPS在300和600 μg/mL浓度下、以及2536-cPS在600 μg/mL浓度下，均显示出显著的细胞毒性，能够抑制癌细胞的活力。一个非常重要的发现是，经过热处理的2536-tEPS以及未经处理的3594-EPS，在所有测试浓度下对HT29-MTX细胞均无毒性作用。这表明热处理可能改变了Y-2536菌株所产EPS的某些特性，从而消除了其细胞毒性。

本研究成功地利用SCW这一乳品工业副产物，通过P. laurentii酵母菌的生物转化，高效生产了具有高附加值的胞内和胞外多糖。该研究不仅为SCW的环境友好型处理和资源化利用提供了切实可行的技术路径，契合循环经济理念，而且对产生的多糖进行了深入的功能表征。研究发现，富含β-葡聚糖的cPS和特定EPS样品对HT29-MTX癌细胞具有选择性细胞毒性，提示它们可能作为生物反应调节剂，在抗癌领域具有应用潜力。而经过热处理后无毒性的EPS以及本身无细胞毒性的EPS样品，则因其安全的特性，在作为食品工业的凝胶剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂，或作为化妆品、生物医学领域的水凝胶基质、保湿剂和伤口愈合剂等方面展现出广阔的应用前景。综上所述，这项研究为实现农业食品副产物的高值化利用和开发新型功能性多糖材料提供了重要的科学依据和实践方案。