蛋白质动态特征在复合物形成中的作用机制研究：以SARS-CoV-2刺突蛋白与ACE2结合为例

《Computational and Structural Biotechnology Journal》：Insights into the role of dynamical features in protein complex formation: the case of SARS-CoV-2 spike binding with ACE2

本研究针对蛋白质-蛋白质复合物结合亲和力的分子决定因素，特别是构象动力学引起的熵贡献尚未完全阐明的问题，研究人员通过分子动力学(MD)模拟，系统分析了SARS-CoV-2刺突(S)蛋白变异体与ACE2受体结合过程中的动态特征。研究发现，更稳定的结合与未结合状态下蛋白质更高的刚性及其与结合后相似的动态模式相关，而近期变异体表现出更动态的行为可能优化了其他性状如免疫逃逸。该研究为理解蛋白质结合强度提供了新视角，强调了研究单个分离伴侣稳定性的重要性。

　　

在结构生物学领域，蛋白质-蛋白质复合物的功能与其相互作用强度密切相关，因此结合亲和力的评估一直是研究的核心焦点。然而，结合亲和力的分子决定因素，特别是构象动力学等熵贡献，仍然没有得到完全理解。这成为了计算生物学中一个基本但尚未解决的挑战。SARS-CoV-2病毒的出现及其刺突(S)糖蛋白与人类血管紧张素转换酶2(ACE2)受体的相互作用，为探索动态和结构特性如何影响蛋白质结合提供了一个极具价值的模型系统。该病毒在复制过程中会产生随机突变，那些能增加适应性的突变被选择性保留，导致了新的变异株出现，这些变异株在S蛋白上具有不同的突变，并导致了与ACE2结合亲和力的实验可测变化，这使得S-ACE2复合体成为研究动态特征如何影响蛋白质结合的完美案例。

为了深入探究构象熵在调节结合强度中的作用，由Greta Grassmann、Mattia Miotto、Francesca Alessandrini、Leonardo Bo’、Giancarlo Ruocco、Edoardo Milanetti和Andrea Giansanti组成的研究团队，在《Computational and Structural Biotechnology Journal》上发表了一项研究。他们利用分子动力学(MD)模拟，系统地分析了五种值得关注的SARS-CoV-2 S蛋白变异体（Alpha, Beta, Gamma, Delta, Omicron）以及野生型(WT)，在它们未结合（apo）和与ACE2结合（holo）两种状态下的结构差异和动态差异，并将这些差异与结合亲和力的变化联系起来。

为开展此项研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：首先，从蛋白质数据库(PDB)获取了野生型及各变异体S蛋白的apo结构及其与ACE2结合的holo复合物结构。其次，利用Gromacs软件平台和CHARMM-36力场，对每个体系进行了500纳秒的分子动力学(MD)模拟，并去除非平衡阶段的前50纳秒数据用于后续平衡态分析。此外，研究还采用了多种生物信息学分析手段，包括计算半径 of 回转半径(R_g)、均方根偏差(RMSD)、均方根涨落(RMSF)、协方差矩阵、主成分分析(PCA)以及弗罗贝尼乌斯距离(Frobenius distance)等，以全面表征蛋白质的结构和动态特性。为了验证模拟采样充分性，还使用了CABS-flex 3.0蛋白质柔性预测工具和HADDOCK柔性对接方法进行辅助分析。

灵活性变化 upon binding

研究人员首先通过比较apo和holo构象的运动来分析结合带来的灵活性变化。半径 of 回转半径(R_g)分析表明，Delta和WT的holo构象比其apo状态更加紧凑。均方根偏差(RMSD)分析显示，所有holo构象都表现出可比且稳定的行为，而apo构象则显示出更高的平均RMSD值和更大的波动，表明ACE2结合稳定了S蛋白。这种稳定效应随着解离常数(K_d)值的增加（即结合亲和力降低）而增强，提示随着SARS-CoV-2的进化，其apo构象的稳定性似乎得到了优化。均方根涨落(RMSF)分析进一步表明，apo轨迹在特定残基处显示出明显的峰，表明局部灵活性较高，而holo构象则显示出更均匀的涨落谱。结合导致界面处灵活性降低，尤其是在Beta、Gamma和Omicron变异体中，Omicron显示出最强的效应。

协变运动分析作为holo和apo构象变化的度量

为了分析所有变异体和WT中S残基的协同运动，研究人员计算了apo和holo模拟中所有残基对原子位置的协方差。结果表明，结合位点处相关运动的差异最为明显。除Delta外，所有变异体的apo状态的最大协方差都超过holo状态，表明结合到ACE2上稳定并固定了界面。这种效应在不同变异体中随着时间的推移似乎变得更加明显。

协方差矩阵的主成分分析揭示了holo和apo构象行为作为不同结合亲和力函数的差异

主成分分析(PCA)显示，holo构象比其apo对应物探索了更受限的构象空间，并且apo和holo结构之间显示出最小的重叠。具有比WT更高K_d值的变异体（Delta和Omicron）在其apo和holo投影的质心之间显示出显著更大的距离，表明经历更显著构象变化的S蛋白倾向于具有更低的结合亲和力。当将所有apo和holo结构的构象投影到一个共同的由前两个主成分(PCs)定义的本质空间时，变异体在apo轨迹本质空间中的分布反映了它们的解离常数，结合亲和力的变化反映在S蛋白的本质运动变化中。对残基载荷的分析表明，结合位点的贡献并不显著高于蛋白质的其余部分。

刺突-ACE2复合物的分析显示了Delta变异体的异常运动

对S-ACE2结合界面残基协方差的分析表明，大多数变异体表现出相似且相对较低的弗罗贝尼乌斯距离，表明它们的S-ACE2相关运动与WT相似。然而，Delta变异体是一个例外，其弗罗贝尼乌斯距离比其他变异体高3-5倍，表明了一种独特的相互作用模式。对S蛋白相对于ACE2的相对运动分析进一步证实，Delta在S和ACE2之间表现出最不协调的运动。这种行为可能与RBD中Delta特异性突变（如L452R）有关，该突变已知会改变界面接触并增强局部灵活性。此外，研究还观察到，随着K_d值的增加，复合物中S和ACE2之间质心距离的波动减小，这意味着结合亲和力更高的复合物表现出更大的距离波动。

综上所述，本研究通过细致的计算分析表明，更稳定的结合相互作用是在S蛋白分离状态下更稳定、且其apo和holo形式之间动力学相似的情况下实现的，这更符合锁钥机制。而结合亲和力较低的变异体则可能遵循一种更动态的机制，如诱导契合，这虽然导致结合较弱，但由此产生的结构灵活性可能在其他病毒适应性方面（如免疫逃逸）赋予优势。Delta变异体在结合动力学上表现出独特的模式，其相对ACE2的旋转协调性较差，这可能与其增强的融合性和传播性有关。重要的是，结合亲和力与S蛋白和ACE2之间分子距离的变异性相关。

这项研究的意义在于，通过探索构象动力学如何影响结合，间接表征了结合熵的构型贡献，这对于大型生物分子复合物来说是影响结合亲和力的最大熵项。研究提出了评估结合界面刚性或相关运动变化如何调节复合物形成的方法，作为对当前计算结合能方法的补充。该工作强调了为了充分理解两个蛋白质之间结合的强度，应该研究每个分离伴侣的稳定性，为理解蛋白质-蛋白质相互作用的分子机制提供了新的重要见解。