λ抗体轻链单残基工程化：通过减少构象灵活性提升热稳定性

《Computational and Structural Biotechnology Journal》：Single-residue engineering of lambda (λ) antibody light chains reduces conformational flexibility and enhances thermal stability

本研究针对λ型抗体轻链生物物理稳定性较差的问题，通过分子动力学模拟发现其铰链区保守的甘氨酸残基（Gly111）是驱动Fab肘角大幅构象转变的关键。研究人员将Gly111突变为苏氨酸（G111T），通过X射线晶体学、差示扫描荧光法（DSF）和表面等离子共振（SPR）等技术证实，该突变在保持Fab结构和抗原结合能力的同时，可将热稳定性提升高达2.5?°C。此单残基工程策略为增强λ型治疗性抗体的稳定性和可开发性提供了新途径。

　　

在生物制药领域，单克隆抗体（mAb）已成为增长最快的一类治疗药物，广泛应用于癌症、自身免疫病和感染性疾病的治疗。抗体分子的Y形结构由两个相同的重链和两个相同的轻链组成，其中轻链主要有κ和λ两种同种型。尽管λ轻链在人体内出现的频率与κ链相当，但大多数已上市的治疗性抗体和基础研究都集中于κ型抗体。一个关键原因在于，λ型抗体Fab片段（抗原结合片段）通常表现出较低的热稳定性和较高的构象灵活性，这为其生产工艺、长期储存和疗效稳定性带来了挑战。λ轻链的这种不稳定性被认为与其铰链区一个额外的氨基酸插入有关，该区域连接可变轻链（VL）和恒定轻链（CL）结构域，并影响着Fab的“肘角”——即可变区（FV）和恒定区（CH1/CL）结构域之间的夹角。λ型Fab的肘角变化范围（112°至227°）比κ型（125°至195°）更广，这种固有的灵活性可能影响其作为治疗药物的开发。因此，寻找一种能够有效稳定λ型抗体结构而又不损害其抗原结合功能的方法，具有重要的科学意义和应用价值。本研究发表于《Computational and Structural Biotechnology Journal》。

为探究λ型Fab的稳定性问题，研究人员主要运用了几项关键技术。他们利用微秒级别的全原子分子动力学（MD）模拟，分析了抗体Fab片段的构象变化和动力学特征。通过X射线晶体学解析了野生型和突变型Fab的三维结构。在生物物理表征方面，采用了差示扫描荧光法（DSF）来精确测量蛋白质的热稳定性（熔解温度T_m），并利用表面等离子共振（SPR）技术定量评估了抗原-抗体结合的动力学参数（如亲和力）。研究所用的λ型Fab（如AMMO1、抗NANP抗体等）均通过哺乳动物细胞（CHO细胞）表达系统进行重组生产。

3.1. Molecular Dynamics of AMMO1

研究人员首先对EBV中和抗体AMMO1的λ型Fab进行了长时间的分子动力学模拟。模拟结果显示，野生型Fab的肘角会在约450纳秒后发生一次大幅度的构象转变，从218°（构象1）跳变到138°（构象2）。这种转变主要由轻链铰链区第111位甘氨酸（Gly111）的骨架二面角（?/ψ）剧烈变化所驱动。由于甘氨酸是构象限制最小的氨基酸，研究团队将其突变为具有β-分支的苏氨酸（G111T）。模拟结果表明，G111T突变有效地“锁定”了Fab的构象，无论从构象1还是构象2开始模拟，突变体都无法在1微秒内发生肘角的大幅转变。主成分分析（PCA）和正态模式分析（NMA）进一步证实，突变体Fab的构象波动范围显著缩小，运动幅度降低。

3.2. Biophysical characterization of AMMO1

理论预测需要实验验证。研究人员成功表达了野生型和G111T突变型AMMO1 Fab。X射线晶体学结构表明，突变并未改变Fab的整体结构，其肘角与野生型相近。最关键的是，差示扫描荧光法（DSF）测量显示，G111T突变将Fab的熔解温度（T_m）从68.5°C提高到了71.0°C，热稳定性提升了2.5°C。此外，研究人员还尝试了在重链铰链区引入S125P突变，但模拟和DSF实验均表明，单独S125P突变不能阻止构象转变或提升稳定性，而G111T/S125P双突变则重现了G111T的稳定效果，凸显了Gly111的关键作用。

3.3. Generalization of Gly substitution - anti-NANP Fab

为了检验这一策略的普适性，研究团队将目光转向了另一个λ型Fab——抗疟疾的抗NANP抗体。该Fab的铰链区序列与AMMO1相同。分子动力学模拟显示，其野生型Fab的肘角同样在137°和243°之间剧烈波动。虽然G112T（对应AMMO1的G111T）突变未能完全“冻结”构象转变，但使其二面角分布更集中，PCA和NMA分析也表明其构象灵活性显著降低。实验数据与模拟结果高度一致：G112T突变将抗NANP Fab的T_m从68.3°C提升至70.8°C。表面等离子共振（SPR）实验进一步证实，这一稳定性提升并未以牺牲功能为代价，突变体与抗原（NPNA）₄₄多肽的结合亲和力与野生型相当。

3.4. Clinical lambda-based Fabs

最后，研究团队将这种单点突变策略推广到三个已进入临床的λ型治疗抗体：Guselkumab、Erenumab和Avelumab。对这些经过高度优化的临床抗体Fab进行分子动力学模拟发现，尽管其野生型的构象波动相对较小，但相应的甘氨酸突变为苏氨酸后，依然能观察到肘角波动范围的减小和构象空间的收缩。PCA和NMA分析在所有三个案例中都重复了之前在模型抗体上观察到的趋势，即突变体Fab的动力学行为更加受限和稳定。

本研究通过计算模拟与实验验证相结合的方式，揭示了一个普遍存在于λ型抗体中的“分子开关”——轻链铰链区的Gly111。该残基的构象灵活性是导致λ型Fab稳定性低于κ型的关键因素之一。将其工程化为苏氨酸（G111T）是一个简单而有效的策略，能够通过提高构象转变的能垒，限制肘角的大幅度波动，从而增强Fab的整体刚性。这种稳定化作用直接转化为热稳定性的提升，且不干扰抗原结合位点的结构和功能。该策略在多种λ型Fab（包括研究用抗体和临床抗体）上均显示出效果，表明其具有良好的普适性。这项工作不仅深化了我们对抗体结构与稳定性关系的理解，更重要的是为优化λ型治疗性抗体的开发提供了一种理性、精准且易于实施的工程方法，有望改善其生产工艺、制剂稳定性和 shelf-life（保质期），具有直接的转化应用前景。