扩增的适应性NKG2C+ NK细胞通过增强ADCC和功能性应答靶向HBV感染肝癌细胞系

《Cytotherapy》：Expanded adaptive NKG2C+ NK cells exhibit potent ADCC and functional responses against HBV-infected hepatoma cell lines

本研究针对慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染及相关的肝细胞癌（HCC）治疗挑战，探索了适应性NK（aNK）细胞的治疗潜力。研究人员利用K562-HLA-E饲养细胞联合IL-2，成功从慢性病毒感染供者体内扩增出高纯度、表型为NKG2C+的aNK细胞。结果显示，扩增后的aNK细胞不仅表现出强大的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和针对HBV感染肝瘤细胞的功能性应答，而且经TGF-β预处理后可获得组织驻留特征（CD103, CD49a），同时保持其功能活性，对自体活化T细胞反应性低，提示其作为肝靶向免疫疗法的良好应用前景，为基于NK细胞的HBV功能性治愈及HCC治疗策略提供了新思路。

　　

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个全球性的重大健康挑战，它是导致慢性肝病和肝细胞癌（HCC）的主要原因之一。尽管有有效的抗病毒药物，但它们很少能实现“功能性治愈”（即乙肝表面抗原HBsAg清除），因此，开发新的治疗策略迫在眉睫。在对抗HBV的免疫大军中，自然杀伤（NK）细胞是驻扎在肝脏中的一线卫士，它们能够识别并清除被病毒感染的细胞和癌细胞。然而，在慢性HBV感染的环境中，常规NK细胞的功能常常受到损害，有时甚至会产生有害的影响，例如表达TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL），这不仅会直接导致肝细胞死亡，还可能抑制本应攻击病毒的HBV特异性T细胞的功能。这就提出了一个关键问题：我们能否“招募”或“训练”出一支更精锐的NK细胞部队，既能有效攻击HBV和肝癌细胞，又能避免误伤友军（如T细胞）和正常肝组织？

近年来，一类被称为“适应性”或“记忆样”NK（aNK）细胞的特殊亚群引起了科学家们的极大兴趣。这类细胞，尤其是在人类巨细胞病毒（HCMV）感染背景下被广泛研究，其特征是高表达一种名为NKG2C的激活受体。与常规NK细胞相比，它们功能更强，能产生更多的干扰素γ（IFNγ），并表现出更强的抗体依赖性细胞毒性（ADCC），这是一种需要抗体（如治疗性单克隆抗体）和表达CD16（FcγRIII）的效应细胞（如NK细胞）共同作用来杀死靶细胞的机制。更重要的是，aNK细胞似乎对免疫抑制环境有更强的抵抗力，并且对活化T细胞的调节性杀伤能力较弱，这使它们成为治疗慢性病毒感染和相关癌症的理想候选者。此前有研究发现，在HBV/HIV合并感染的患者中，NKG2C⁺的aNK细胞亚群更为突出，且与更好的HBV控制相关。那么，能否从慢性HBV感染患者体内大量扩增出这种具有强大战斗力的aNK细胞，并用于治疗呢？这就是本研究旨在回答的核心问题。相关研究成果发表在《Cytotherapy》期刊上。

为了开展这项研究，研究人员采用了几项关键的技术方法。他们从接受抗病毒治疗、病毒载量已抑制的慢性HBV感染或HBV/HIV合并感染供者（共30名）的外周血单核细胞（PBMC）出发，首先去除了T细胞和B细胞。随后，利用经过辐照的K562-HLA-E饲养细胞（预先负载HLA-G衍生肽）联合白细胞介素-2（IL-2），对剩余的细胞进行为期11天的扩增培养。为了模拟肝脏免疫抑制环境并赋予NK细胞组织驻留特性，他们在部分实验中额外加入了转化生长因子-β（TGF-β）。研究人员通过流式细胞术详细分析了扩增前后NK细胞的表型特征。功能评估则包括：使用抗CD20抗体包被的Raji细胞检测ADCC能力；使用K562细胞、肝瘤细胞系（PLC/PRF/5, HepG2-NTCP）以及HBV感染的肝瘤细胞（de novo感染的HepG2-NTCP和HepG2.2.15）作为靶标，检测NK细胞的脱颗粒（CD107a表达）、细胞因子（IFNγ, TNFα）产生和直接杀伤能力（Toxilight法和xCELLigence实时细胞分析）；并评估了扩增的aNK细胞对自体活化CD4⁺和CD8⁺ T细胞的反应性。

扩增的NK细胞保留适应性表型

研究人员成功建立了一套扩增体系。经过11天的培养，获得的NK细胞纯度超过97%，总NK细胞平均扩增了50倍，而其中NKG2C⁺的NK细胞更是惊人地平均扩增了100倍。表型分析证实，这些扩增的细胞确实呈现出典型的aNK细胞特征：它们高表达NKG2C，而抑制性受体NKG2A的表达水平相对较低；同时，它们高表达颗粒酶B（Granzyme B，显示强大的细胞毒性潜力）、激活受体（如CD69, DNAM-1, NKG2D, NKp30, NKp46）以及对于ADCC至关重要的CD16和CD2。虽然抑制性受体LAG-3的表达有所上调，但耗竭相关标志物如PD-1、TRAIL或PD-L1的表达并未显著增加。这些结果表明，该扩增 protocol 能够高效地从慢性病毒感染供者体内获得大量具有aNK细胞表型的细胞群体，以下简称扩增的aNK细胞。

扩增的aNK细胞表现出增强的ADCC能力

接下来，研究人员检验了这些扩增细胞的战斗力。首先，它们对抗原呈递细胞模型K562 HLA-E细胞的反应显著增强，其IFNγ产生、脱颗粒（CD107a表达）和直接杀伤能力均远超扩增前的NK细胞。更重要的是，在ADCC测试中，当与抗CD20抗体联合使用时，扩增的aNK细胞对Raji细胞的杀伤效率也显著提升。值得注意的是，进一步分析显示，扩增群体中NKG2C⁺的细胞亚群在功能和ADCC方面的提升幅度要大于总NK细胞群体，说明扩增策略特别优化了这支部队的作战能力。

扩增的aNK细胞对肝瘤细胞系和HBV感染靶细胞表现出增强的反应性

研究的重点是评估aNK细胞对抗HBV相关肝癌的潜力。他们使用了三种肝瘤细胞模型：PLC/PRF/5（整合了HBV DNA并分泌HBsAg，通常对NK细胞杀伤不敏感）、HepG2-NTCP（可被HBV感染）以及持续产生病毒颗粒的HepG2.2.15细胞。结果显示，扩增的aNK细胞对所有这三种肝瘤细胞系，无论是否感染HBV，都表现出比扩增前NK细胞更强的脱颗粒和杀伤活性。实时细胞分析（xCELLigence）进一步证实，扩增的aNK细胞能够有效抑制HepG2-NTCP细胞的生长。这表明，aNK细胞有能力克服肝癌细胞营造的免疫抑制环境，并对其进行有效攻击。

TGF-β条件化赋予组织驻留表型并维持功能反应

考虑到肝脏微环境中富含免疫抑制因子TGF-β，研究人员尝试在扩增过程中加入低剂量的TGF-β进行“预处理”，以期让aNK细胞提前适应肝脏环境并获得“驻扎”在肝脏的能力。令人欣喜的是，TGF-β的加入并没有妨碍aNK细胞的扩增和其主要的适应性表型（如高表达NKG2C, CD2, NKG2D等）。同时，这些细胞成功地获得了组织驻留NK细胞的标志，如CD103、CD49a和CXCR3的表达显著上调。最关键的是，这种“ preconditioning ”并没有削弱它们的功能，其ADCC能力和对HepG2-NTCP细胞的杀伤效力与仅用IL-2扩增的aNK细胞相当。这意味着，研究人员成功制备出了一支既具备强大战斗力，又可能更好地归巢到肝脏并适应其局部环境的“特种部队”。

扩增的aNK细胞对自体活化T细胞显示出极低的反应性

在免疫系统中，NK细胞有时会扮演“调节者”的角色，清除过度活化的免疫细胞（如T细胞）以维持平衡。但在对抗慢性病毒感染时，这种对T细胞的杀伤可能是有害的，会削弱关键的抗病毒T细胞反应。本研究有一个非常重要的发现：与扩增前的NK细胞相比，扩增的aNK细胞对自体、经抗CD3/CD28抗体激活的CD4⁺和CD8⁺ T细胞几乎不产生脱颗粒反应（即很少发动攻击）。深入分析发现，在扩增前的NK细胞中，对活化T细胞的反应主要来自NKG2C^-的群体，而扩增后以NKG2C⁺为主的aNK细胞群体则表现得非常“克制”。这一特性极具治疗价值，因为它意味着输注扩增的aNK细胞可能不会抑制患者体内宝贵的抗HBV T细胞免疫，从而有望形成协同作战的良好局面。

本研究成功验证了利用饲养细胞法从慢性病毒感染个体中扩增aNK细胞的可行性。所获得的细胞不仅数量可观、纯度高，而且具备强大的直接杀伤、ADCC以及对抗HBV感染肝瘤细胞的能力。尤为重要的是，这些细胞不表达可能介导肝损伤和T细胞抑制的分子（如TRAIL, PD-L1），并且对自体活化T细胞反应性极低，这减少了潜在的非靶向副作用风险。通过TGF-β预处理，还能在不牺牲功能的前提下赋予其肝脏组织驻留特性，增强了其靶向肝脏疾病的潜力。这项研究为开发基于aNK细胞的过继免疫疗法奠定了坚实的实验基础，为攻克HBV功能性治愈和HBV相关HCC这两大难题提供了充满希望的新策略。未来，将此类疗法与现有的抗病毒药物或治疗性单克隆抗体联合应用，或许能产生协同效应，为患者带来新的希望。