综述：环境RNA作为水生生态系统健康评估的变革性工具：进展与挑战

《Ecological Indicators》：Environmental RNA as a transformative tool for aquatic ecosystem health assessment: progress and challenges

本文系统综述了环境RNA（eRNA）技术在水生生态系统健康评估中的前沿进展。文章指出，相较于环境DNA（eDNA），eRNA因其在环境中存留时间短、仅由活体生物转录产生等特性，在降低物种检测假阳性率、识别代谢活跃群落、实时反映生物 assemblage 状态方面展现出独特优势。综述详细梳理了eRNA的技术流程（包括采样、过滤、提取、反转录和检测）、理论框架（如存留动力学）、四大应用场景（生物多样性监测、生理状态评估、免疫反应与病原检测、环境应激响应评估），并深入探讨了当前面临的可行性验证、方法优化、应用框架构建等核心挑战（“迷雾”），最后对未来发展方向进行了展望，认为eRNA技术虽潜力巨大，但目前仍处于起步阶段，是前景而非替代方案。

　　

引言

水生生态系统健康评估正经历从传统理化监测向分子生物监测的范式转变。环境DNA（eDNA）技术虽已广泛应用于生物多样性评估和入侵物种检测等领域，但其存在一定局限性，例如eDNA在生物离开后仍可在环境中存留数周，提供的是历史信息而非实时信息，且可能随水流长距离迁移，导致假阳性检测。环境RNA（eRNA）作为一种创新的生物监测工具，有望克服eDNA分析的局限性。eRNA存留时间短，并与代谢基因表达相关，能有效降低假阳性率，识别代谢活跃群落，提供生物群落的实时信息。eRNA技术始于2014年对海洋浮游细菌群落的评估研究，其来源包括水体、空气、土壤和沉积物等环境介质，可能来自大型生物释放的RNA或微生物内含的RNA，以细胞、囊泡或游离分子片段形式存在。尽管eRNA在环境中不如eDNA稳定，但其存留时间足以被检测（通常为数十小时），且因其降解快，不易长距离迁移，从而减少了假阳性物种检测。eRNA具有更高的阳性检测率和更低的假阳性率，能以更高的时空分辨率反映物种存在与否，更好地体现物种多样性。

基本假设与理论框架

eRNA技术的概念基础在于其环境存留时间短，且RNA仅由活体生物转录产生。因此，eRNA可作为数十小时内代谢活跃生物群落的代表，通过检测基因表达获取生理信息。然而，eRNA能否在环境中存留足够长的时间以供检测是该技术可行性的关键前提。eRNA的环境存留时间及其降解影响因素对于基于eRNA的监测方法的可行性和标准化至关重要。目前，我们对eRNA在自然生态系统中的产生、状态、运输和归宿的理解仍很有限。

研究表明，eRNA在生物移除后可被检测到13-57小时，但其确切存留时间仍未确定。eRNA的半衰期比eDNA短4-5小时，约为8.84-13.54小时，具体取决于分子标记和RNA类型的选择。不同基因标记来源的eRNA降解速率不同，不同RNA类型在环境中的存留时间也各异。核信使RNA（mRNA）存留时间最短（<24小时），而线粒体RNA和核糖体RNA（rRNA）分别可存留约72小时和>240小时。核mRNA可能是指示采样区域近期存在活体生物的最佳指标。

eRNA在水生环境中的降解速率受多种生物和非生物因素影响，如水温、pH、紫外线照射、盐度、基质组成、浊度和水化学等。现有研究表明，温度升高会同时促进eDNA和eRNA的降解。eRNA降解在碱性条件下加速，在酸性条件下受抑制。然而，关于eRNA与eDNA降解速率的比较，以及温度和pH对eRNA存留影响的研究结论存在矛盾，这可能源于实验条件、物种差异、所用遗传靶点不同等因素。eRNA降解的整体趋势以及温度和pH影响该过程的程度仍不明确，这阻碍了eRNA降解动力学的预测和基于检测数据估算丰度模型的发展。

由于eRNA存留时间短且仅由活体生物转录，为便于分析检测结果，通常假设通过eRNA技术检测到的群落是活跃的。但目前尚无证据支持这一假设，这是知识上的一个重要空白。eRNA更准确地反映了代谢活跃的生物，但其在不同物种间的表达动态尚未完全明了。此外，检测到的eRNA变化尚未得到充分验证。基因表达因个体和组织类型而异，环境样本包含来自多种组织的输入，这使基因表达研究复杂化，并可能显著影响eRNA的应用。

技术流程与方法学模式

基于现有研究，eRNA的技术流程可总结为：水样过滤收集eRNA、eRNA提取、基因组DNA（gDNA）去除、互补DNA（cDNA）合成、代谢条形码和目标基因检测。

由于eRNA存留时间短，水样应尽快过滤（理想情况下在4小时内）。通常使用玻璃纤维滤膜，滤膜孔径选择尚无明确共识，但0.45 μm和0.7 μm是最常用的孔径。过滤后，滤膜需快速冷冻并在-80°C下保存，或使用RNAlater等缓冲液在-20°C或4°C下保存。

eRNA提取应在冰上进行，尽量减少冻融循环。常用提取试剂盒包括RNeasy Mini Kit、ZR-Duet DNA/RNA Mini Prep Kit Plus等。提取的eRNA应储存在-80°C。增加裂解缓冲液体积可能提高eRNA产量和提取效率。

去除gDNA污染对可靠的eRNA检测至关重要，但过度去除会显著降低eRNA产量，可能导致假阴性。目前尚无最佳gDNA去除比例的共识。

cDNA合成涉及cDNA文库构建、rRNA去除和cDNA合成。反转录策略显著影响eRNA定量和转录组多样性。随机引物能捕获完整和片段化的eRNA，提供最全面的回收，可能是最佳方案。但基因特异性引物可能增加多个线粒体和核基因的eRNA检测。目前尚无最优反转录引物策略的共识。

eRNA分析主要有三种方法：定量PCR（qPCR）、微滴式数字PCR（ddPCR）和高通量测序。高通量测序是目前最广泛应用的方法，适用于涉及多个生物类群的实验。qPCR和ddPCR用于特定目标基因的定量分析。

eRNA技术的关键瓶颈在于获取足够的eRNA样本进行检测，特别是mRNA样本。mRNA在细胞中占总RNA的比例不足5%，且更不稳定，在环境中浓度极低。在高通量测序前需去除rRNA以富集mRNA，但此过程可能导致mRNA损耗。因此，特定mRNA的定性检测和定量分析仍具挑战性。

eRNA技术的标准化也面临挑战。技术参数因研究目标、样本类型和生物类群而异。由于eRNA研究数量有限且缺乏支持技术标准建立的专门实验，为eRNA技术制定技术标准为时尚早。

eRNA技术固有的假阴性问题，由其快速降解速率引起，也带来了灵敏度限制，尤其对低丰度序列。相比之下，eRNA技术假阳性的可能性显著低于eDNA。由于采样随机性、样本处理偏差等因素，对某些功能基因mRNA进行精确定量分析仍具挑战性。

应用场景与案例研究

生物多样性监测

eRNA通过代谢条形码或宏转录组学实现物种检测和群落组成分析。其方法利用所有细胞大量产生的丰富RNA分子，如rRNA或线粒体RNA。研究表明，eRNA技术能更准确地估计物种分布和丰度，具有更高的阳性检测率和更低的假阳性率。与eDNA相比，eRNA能更好地区分和量化活体群落，因其仅由活跃转录的基因产生，且降解更快。eRNA还能提供更详细的种群信息，如性别组成、年龄结构和表型，并可用于检测入侵物种。eRNA与eDNA浓度比值可用于预测核酸的年龄，从而更准确地解释物种分布。

生理状态评估

eRNA技术与代谢途径基因表达直接相关，可作为检测环境样本中“活”信号的更好指标。环境或生理条件的变化可使遗传背景几乎相同的生物表现出不同的RNA表达模式，这使得利用eRNA评估特定物种、种群或群落的生理状态和代谢活动成为可能。例如，eRNA分析可用于检测两栖动物幼虫生命阶段的存在，确定目标物种的产卵地点。持家基因是eRNA应用的理想mRNA靶标，因其维持基本的细胞和生物功能，并在各种环境条件下持续表达。对D. rario的研究表明，通过eRNA技术检测不同生理状态下特异性表达的mRNA，可以监测个体生物的生理状态。

免疫反应评估与病原检测

eRNA能深入理解病原感染以及种群对病原或其他环境压力源引发的免疫反应的生理响应。已识别出几个与病原体和免疫反应相关的潜在有用eRNA靶标。例如，D. rario感染Salmonella后免疫器官中itln2、itln3和itln5基因上调。虽然直接实验证据目前有限，但理论上利用eRNA评估生物体免疫反应是可行的。eRNA还可用于开发病原体检测探针，并分析病媒/宿主在 urban 水体中的eDNA/eRNA，以了解其栖息地和时空动态，预测潜在的新传播点。

环境健康评估

eRNA可用于理解水生群落如何随时间应对压力。eRNA包含来自大型生物和微生物通过转录基因表达的大量功能信息，能够检测环境胁迫下的差异基因表达。现有研究表明，eRNA可以检测生物体对热应激和化学污染物的反应。例如，利用水蚤作为实验模型，证明基于eRNA的环境转录组学可以揭示真核生物群落对热应激的功能响应。eRNA可能是检测急性暴露后群落反应的更好模板，而eDNA可能更适用于检测慢性暴露后的变化。eRNA在检测污染物暴露引起的细微群落变化方面比eDNA更有用。eRNA基因表达谱可用于监测化学暴露后鱼类组织基因表达的变化，从而评估水生生物的健康状况。

microRNA（miRNA）的检测为识别水生生物应激反应提供了新方法。miRNA调节基因表达并介导鱼类对各种压力源的反应。研究成功地在暴露于急性气压的O. mykiss的环境样本中检测到差异表达的miRNA，表明miRNA可作为鱼类急性应激的非致死性指标。由于miRNA在鱼类和其他脊椎动物中具有保守性，测量水生环境中的miRNA可以揭示整个鱼类或脊椎动物群落的信息。

eRNA应用的挑战

生物多样性监测可通过检测分子标记实现，当前技术基本能满足要求，具有实际野外应用的巨大潜力。而生理状态评估、免疫反应与病原检测、环境健康评估需要检测特定的功能基因转录本mRNA，这些研究相对较少，且大多处于实验室阶段，尚未有在野生环境中成功实施的报道。除生物多样性监测外，其他应用领域的研究相对有限。

eRNA有潜力揭示“活跃表达的功能基因”群落。在生物多样性监测中，仅通过eRNA检测到的群落往往生物量低但活性高，这弥补了eDNA的一些局限性。结合eRNA和eDNA技术可以克服单独使用任一种方法的限制。研究表明，eDNA和eRNA数据在检测类群方面具有很强的互补性。对于大型生物，eDNA信号较强，而eRNA可检测性较低。建议在资源、时间和专业知识允许的情况下，在基于代谢条形码的生物监测调查中同时使用eDNA和eRNA，以获得更可靠和令人信服的数据。

eRNA技术是现有eDNA技术的优化方案，但并非唯一选择。eRNA的mRNA组分提供了eDNA技术无法捕捉的“动态”和“功能”信息，使其成为一个有前景且当前流行的研究领域。然而，由于mRNA比例低、多样性高、在水中降解快，检测特定mRNA比检测rRNA困难得多。基因表达变化难以预测，且因不同因素差异很大，选择特定靶基因进行检测具有挑战性。目前，对目标物种对应mRNA数据库的要求极为严格，限制了实验主要在模式生物中进行。大多数受保护或管理物种缺乏足够的基因组资源。mRNA类型的巨大多样性使构建全面的mRNA数据库复杂化，阻碍了eRNA在这些目的上的实际应用。

讨论

理论“迷雾”与展望

eRNA使用的可行性尚未完全确立，其结果可靠性和解释性存疑。当前研究对eRNA和eDNA的降解速率以及温度、pH对eRNA降解的影响尚未达成共识。eRNA降解速率的不确定性使得无法准确确定检测物种在采样环境中的时空存在，也阻碍了对检测限的清晰理解。鉴于基因表达的复杂性和可变性，在缺乏进一步实验证据的情况下，eRNA作为活跃生物群落代表的假设仍未得到验证。此外，利用eRNA检测基因表达变化和推断生物生理状态的理论框架缺乏，限制了结果的解释性。

为解释检测结果，必须充分了解eRNA在水生环境中的存留性。需要更多证据来填补当前的知识空白。需进一步研究各种RNA类型在水中的存留性，以及eRNA在更极端环境条件下是否仍可检测。应在包含多样化生物群落、更接近自然环境的水生生态系统中进行探索性实验，以探索eRNA能检测到尽可能多物种的时间范围。水生系统中的环境条件既影响eRNA的存留，也影响生物体内基因的转录和释放，在评估环境变量对eRNA存留影响时必须考虑这些因素。

从理论上讲，基于RNA的结构特征，其降解速率应高于DNA。eRNA的降解速率预计会因水体类型不同而异，在酸性条件下更稳定，在碱性条件下稳定性较差，且耐热性不如DNA。关于eRNA降解速率趋势以及温度、pH影响的明显矛盾可能源于实验条件的差异。对这些方面的研究仍然有限，因此需要更多研究来提供更清晰的答案。

基因表达机制的研究复杂且具有挑战性，因此基因表达变异性和复杂性的影响短期内无法完全解决。然而，通过持续研究，有可能建立标准化标准。迫切需要定义标准化的判别阈值，并验证eRNA信号与实际生物量及生理状态之间的定量关系，以防止对生态功能的误解。

方法学“迷雾”与前进路径

与eDNA相比，eRNA分析需要更严格的保护措施以防止现场样品采集和储存过程中的降解。此外，eRNA分析涉及额外的反转录步骤，延长了实验室流程，增加了分析成本。但随着测序成本的持续下降以及保存成本（虽高于eDNA）仍可接受，成本将不再是采用eRNA技术的障碍。

由于技术瓶颈，在野外收集足够的eRNA样本具有挑战性，这使得某些mRNA的检测变得复杂，且难以实现定量分析。样品保存的瓶颈导致部分eRNA在采集后降解，特别是痕量序列可能降解到难以检测的水平。由于环境样本中RNA丰度低且易降解，测序深度不足会阻止某些序列的检测；与eDNA相比，这个问题更为突出。测序方法的局限性包括反转录过程中的潜在错误以及可能导致样本丢失的额外处理步骤。反转录和RNA测序过程中的错误率尚可接受；然而，样品处理损失会显著影响结果。这些挑战直接影响数据可靠性及其解释的准确性。

目前，eRNA的技术方面需要进一步研究。eRNA技术需尽可能减少采集样本中eRNA的降解，同时保持低成本