低共熔溶剂提取黄豌豆蛋白的比较研究：一种食品加工中的新型绿色提取技术

《Food Hydrocolloids》：Comparative study on yellow pea protein extracted with deep eutectic solvent: A novel and eco-friendly solvent in food processing

本刊推荐：为解决传统植物蛋白提取方法存在的环境污染和功能性质损失等问题，研究人员开展了采用低共熔溶剂（DES）提取黄豌豆蛋白（YPP）的创新性研究。结果表明，DES提取法在保持高蛋白纯度（91.84%）的同时，获得了最高的蛋白得率（72.49%）和回收率（19.70%），且其乳化活性指数（EAI）、乳化稳定性指数（ESI）和起泡能力等关键技术功能性质优于或相当于传统方法。该研究为开发可持续、高效的植物蛋白绿色提取工艺提供了重要理论依据和实践方案。

　　

随着全球人口增长和饮食结构变化，蛋白质需求预计到2054年将增加9.435亿公吨，这促使人们寻找动物蛋白的替代品。植物蛋白因其可持续性而受到青睐，不仅用于人类饮食，在制药、宠物食品、功能性产品等领域也展现出巨大潜力。植物蛋白的技术功能性质（如作为粘合剂、乳化剂、发泡剂等）扩展了其在食品工业中的应用。然而，植物蛋白的提取方法对其技术功能性质和消化率有着重要影响。

目前，植物蛋白的分离主要采用湿法和干法提取技术。干法分馏虽然能耗和总成本较低，但蛋白得率和纯度低是其主要瓶颈。湿法提取对于获得高蛋白得率和纯度至关重要，常见方法包括碱溶酸沉、盐提取和膜过滤等。但这些传统方法往往导致技术功能性质丧失、消化率降低、颜色和味道不佳以及严重的环境污染。因此，开发新型、环境友好的植物蛋白提取方法，旨在提高得率的同时保持纯度和技术功能性质，变得至关重要。

在此背景下，低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents, DES）作为一种绿色提取技术应运而生。DES是由氢键受体（HBA，如胆碱氯化物）和氢键供体（HBD，如甘油）按特定摩尔比混合形成的低共熔混合物，具有低毒性、可生物降解、制备简单等优点，被视为传统有机溶剂的绿色替代品。DES在食品工业中因其能溶解极性和非极性化合物而受到关注。已有研究表明，DES能够高效提取牛血清白蛋白（BSA）和蚕豆蛋白，且不改变蛋白质构象。然而，关于DES提取的黄豌豆蛋白（Yellow Pea Protein, YPP）的结构和技术功能性质与传统提取方法的比较，目前尚缺乏系统研究。

为了填补这一知识空白，曼尼托巴大学食品与人类营养科学系的Oladipupo Odunayo Olatunde和Nandika Bandara在《Food Hydrocolloids》上发表了一项题为“Comparative study on yellow pea protein extracted with deep eutectic solvent: A novel and eco-friendly solvent in food processing”的研究。该研究旨在全面比较DES提取的黄豌豆蛋白与常规提取方法（盐提取SP、等电沉淀pH、空气分级AC）以及商业黄豌豆蛋白（YPP-CO）在纯度、热特性、形态和技术功能性质方面的差异。

研究人员采用了多种关键技术方法对蛋白样品进行表征。他们使用凯氏定氮法测定蛋白纯度、得率和回收率；通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析蛋白质二级结构；利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白质谱；采用动态光散射法测定Zeta电位；使用差示扫描量热法（DSC）评估热特性；通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察蛋白形态；并系统测定了蛋白溶解度、乳化活性指数（EAI）、乳化稳定性指数（ESI）、起泡能力（FC）、起泡稳定性（FS）、持水能力（WHC）和持油能力（OHC）等技术功能性质。

3.1. 不同提取方法对YPP蛋白纯度、回收率和得率的影响

研究首先比较了不同DES浓度（20%、40%、60%、80%）对提取效果的影响。结果显示，蛋白纯度（PP）和蛋白得率（PY）随着DES浓度增加至60%呈现显著上升趋势，在60% DES时获得最高PY（72.49%）和较高的PP（91.84%）。然而，在80% DES时，虽然PP达到峰值（95.3%），但PY下降至65.48%，表明在高DES浓度下纯度和得率之间存在权衡。蛋白回收率（PRR）则呈现相反趋势，在20% DES时最高（22.84%），并随着DES浓度增加而持续下降，在80% DES时降至最低（17.26%）。这表明增加DES配方中的水含量有助于提高蛋白回收率，但会牺牲纯度。最终选择60% DES进行后续研究，因其在不过度牺牲蛋白纯度和减少溶剂用量的前提下，获得了较高的PY和PRR。

进一步比较不同提取方法（DES提取60%、盐提取SP、等电沉淀pH、空气分级AC）的效果，并以商业YPP（YPP-CO）为参考。蛋白纯度（PP）、回收率（PRR）和得率（PY）的范围分别为48.83-98.70%、13.23-21.02%和51.84-74.17%。盐提取蛋白（YPP-SP）的纯度最高，DES提取蛋白（YPP-DES）次之，空气分级蛋白（YPP-AC）最低。YPP-SP的PRR和PY最低，而YPP-DES和等电沉淀蛋白（YPP-pH）的PRR和PY无显著差异。这表明DES提取法在得率和回收率方面具有优势，而盐提取法虽然纯度高，但得率和回收率低限制了其工业应用。

3.2. 不同提取方法对蛋白质结构的影响

通过FTIR光谱分析发现，不同方法提取的YPP光谱模式相似，但在波数和振幅上存在细微差异，表明提取方法诱导了蛋白质构象变化。对酰胺I带（1600–1700 cm^-1）进行二阶导数和曲线拟合，分析蛋白质二级结构组成。YPP-DES的α-螺旋（10.39%）和β-转角（5.68%）含量最低，β-折叠含量中等（18.49%），表明DES的离子性质导致了部分蛋白质解折叠。YPP-SP显示出较高的β-折叠（17.99%）和分子间β-折叠（27.7%）。YPP-pH含有较高的β-转角（21.29%）。YPP-AC保留了最高的α-螺旋含量（45.43%），说明其结构完整性保持得最好。这些结果表明，DES提取能够在保持有序结构和无序结构之间取得平衡。

3.3. 不同提取方法对YPP蛋白质谱的影响

SDS-PAGE分析显示，无论采用还原还是非还原条件，所有提取物中均鉴定出脂氧合酶（94 kDa）、豆球蛋白（72 kDa）、豌豆球蛋白（~50 kDa）以及豆球蛋白的酸性亚基（37–40 kDa）和碱性亚基（19–22 kDa）。YPP-SP中所有蛋白条带强度最高，表明盐沉淀法较好地保留了这些蛋白亚基的完整性。在YPP-DES中观察到一些蛋白质降解，这可能与其制备过程中的热处理有关。商业YPP（YPP-RF）在非还原条件下仅观察到少量条带，表明其可能存在较多的二硫键交联。

3.4. 不同提取方法对表面疏水性和Zeta电位的影响

表面疏水性（SOH）和Zeta电位（ZP）是影响蛋白质技术功能性质的关键因素。在pH 7条件下，SOH指数范围在1166至2031之间，ZP范围在-15.09至-19.05 mV之间。YPP-pH的SOH最高，表明极端pH条件导致了蛋白质显著解折叠和疏水基团暴露。YPP-AC的SOH最低，接近天然大豆蛋白的状态。YPP-DES和YPP-SP的SOH略高于YPP-AC但无显著差异，表明它们仅引起天然蛋白质的轻度解折叠。所有蛋白质在pH 7时均带负电荷（高于其等电点pI）。YPP-pH的ZP绝对值最高，YPP-RF最低。除YPP-RF外，其他样品的ZP无显著差异。这表明提取方法对蛋白质净电荷影响不大。

3.5. 不同提取方法对YPP颜色属性的影响

提取方法显著影响YPP的色泽。亮度L值范围78.47-89.94，红度a值范围1.38-5.12，黄度b值范围19.55-28.37。L值顺序为YPP-AC > YPP-SP > YPP-DES > YPP-pH > YPP-RF。YPP-AC和YPP-RF较低的L值可能与蛋白质共提取的多酚有关。YPP-AC和YPP-DES的b值（黄度）无显著差异，且低于其他样品。YPP-DES较低的黄度可能与其制备过程中的热处理导致类胡萝卜素降解有关。a*值（红度）在YPP-AC中最低，YPP-DES次之，YPP-SP最高。

3.6. 不同提取方法对YPP热特性的影响

DSC分析显示，所有样品均出现两个吸热峰，分别对应豌豆球蛋白和豆球蛋白的变性。对于提取的样品，豌豆球蛋白的变性温度（T_d）和变性焓（ΔH）范围分别为146.19-156.83 °C和45.87-66.44 J/g蛋白，豆球蛋白则分别为211.26-234.82 °C和10.18-18.79 J/g蛋白。YPP-SP两种蛋白亚基的变性温度均最高，这与盐存在下蛋白质四级结构更耐变性的报道一致。YPP-DES较低的变性温度可能与其制备过程中的热处理导致的部分变性有关。本研究测得的变性温度远高于通常报道的豌豆蛋白变性温度（80-90 °C），这归因于DSC分析使用的是干燥蛋白粉末而非蛋白质溶液，蛋白质在无水条件下热稳定性更高。

3.7. 不同提取方法对YPP形态的影响

FE-SEM观察显示，所有实验室提取的蛋白质（YPP-DES, YPP-SP, YPP-pH, YPP-AC）均呈现片状结构，而商业YPP（YPP-RF）为球形中空结构。这种差异可能与商业蛋白采用的喷雾干燥工艺有关。片状结构是冷冻干燥植物蛋白的典型形态。YPP-AC中观察到淀粉或其他细胞材料（红色箭头指示），这与其较低的蛋白纯度一致。结果表明，提取方法本身不影响蛋白质的形态，但干燥方式对其有显著影响。

3.8. YPP的技术功能性质

3.8.1. 蛋白质溶解度

所有YPP在等电点附近（pH 4-5）的溶解度最低。在pH 3时，YPP-SP的溶解度最高，其次是YPP-pH和YPP-DES，YPP-AC最低，表明它们适用于酸性饮料。在中性pH 7时，溶解度顺序为YPP-pH > YPP-AC > YPP-DES > YPP-SP > YPP-RF。YPP-pH的高溶解度与其较高的Zeta电位（绝对值）相关。YPP-RF的低溶解度可能与其喷雾干燥过程中导致的蛋白质变性和疏水相互作用增强有关。

3.8.2. 持油能力和持水能力

持油能力（OHC）和持水能力（WHC）的值范围分别为1.04-2.11 g/g和1.08-4.01 g/g。YPP-RF的OHC和WHC最高，YPP-AC最低。WHC与蛋白纯度呈正相关，顺序为YPP-SP > YPP-DES > YPP-pH > YPP-AC。YPP-pH的OHC高于YPP-SP和YPP-DES，这与其较高的表面疏水性相关，表明其暴露了更多的疏水基团可与油相互作用。

3.8.3. 乳化能力

乳化活性指数（EAI）和乳化稳定性指数（ESI）的范围分别为17.01-27.82 m²/g和32-131.6分钟。YPP-SP的EAI和ESI最高，其次是YPP-DES，YPP-AC最低。这一趋势与蛋白纯度正相关。尽管YPP-pH和YPP-AC在pH 7时溶解度较高，但其EAI较低，表明溶解度不是影响乳化性的唯一因素，蛋白质在界面的迁移和展开能力更为关键。

3.8.4. 起泡能力

起泡能力（FC）和起泡稳定性（FS）的范围分别为161.11-206.67%和4.35-20.74%。YPP-DES和YPP-SP的FC和FS显著高于其他样品，且两者之间无显著差异。这与其高蛋白纯度以及合适的分子特性（如表面疏水性、溶解度等）有关。优异的起泡特性使YPP-DES和YPP-SP成为食品应用中理想的蛋白配料。

本研究证实了低共熔溶剂（DES）作为一种创新且环境友好的黄豌豆蛋白（YPP）提取方法的有效性。DES提取法实现了高蛋白回收率和得率，诱导的蛋白质构象变化小于碱提取法，且其技术功能性质优于或相当于传统方法。DES提取的YPP在纯度、得率和功能性质方面展现出综合优势，为可持续和高效的植物蛋白生产提供了一条有前景的绿色途径。未来研究需要评估DES提取工艺的规模化可行性、经济性，以及在真实食品体系中的应用性能，并检测最终蛋白产品中可能的DES残留以确保食品安全。这项工作为推动绿色化学在食品工业中的应用，开发更可持续的植物蛋白资源提供了重要的科学依据和技术支持。