综述：园艺作物基因组编辑：增强性状发育和胁迫抗性

《Horticultural Plant Journal》：Genome editing in horticultural crops: Augmenting trait development and stress resilience

本综述系统阐述了CRISPR/Cas9及其衍生技术（如碱基编辑器和先导编辑器）在园艺作物精准育种中的最新进展。文章重点总结了该技术在改良果实品质、延长货架期、增强生物/非生物胁迫抗性等方面的关键成就，并深入探讨了递送系统、脱靶效应、再生能力等技术瓶颈。同时，综述还分析了基因组编辑作物面临的监管框架、伦理争议和公众接受度等产业化挑战，为开发气候智能型高产优质园艺作物提供了重要见解。

　　

1. 引言

园艺作物在全球营养和农业经济中扮演着重要角色，但其生产力正日益受到气候变化、生物及非生物胁迫的挑战。传统育种方法耗时且受物种兼容性限制。CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白9）技术的出现彻底改变了精准育种领域，它能够实现靶向基因修饰，从而增强作物的产量、抗病性和胁迫耐受性。该技术已成功应用于果树、蔬菜和观赏作物，在果实成熟、风味、抗病性等性状改良方面取得了显著成果。此外，碱基编辑和先导编辑等新技术提供了更高的精确度，并降低了意外突变的风险。

尽管取得了重大进展，但CRISPR/Cas9在非模式园艺物种中的广泛应用仍面临技术障碍，例如低效的递送系统、脱靶效应以及许多物种有限的再生能力。从实验室到市场的路径还受到复杂的监管框架和公众认知的影响。

1.1. CRISPR/Cas9的工作机制

CRISPR/Cas9系统源于细菌的适应性免疫机制，其核心组件包括负责切割DNA的Cas9核酸酶和将其精确引导至靶位点的单链向导RNA（sgRNA）。该系统通过三个主要阶段发挥作用：适应、表达和干扰。当细胞遭遇外源病毒DNA时，会将其片段整合到自身的CRISPR阵列中，形成免疫记忆。再次遭遇入侵时，细胞会转录出前体crRNA（pre-crRNA），它与反式激活crRNA（tracrRNA）结合，在Cas9蛋白和RNAase III作用下形成成熟的crRNA。最后，成熟的crRNA引导Cas9蛋白切割靶标DNA，造成双链断裂（DSB）。细胞随后通过两种主要机制修复断裂：容易出错的非同源末端连接（NHEJ）途径，可能导致基因敲除；以及需要模板的同源重组修复（HRR）途径，可实现精确的基因插入、缺失或替换。

与早期的基因组编辑技术（如锌指核酸酶ZFNs和转录激活因子样效应物核酸酶TALENs）相比，CRISPR/Cas9依赖于RNA-DNA相互作用，具有设计简单、成本低、可多重编辑等优势，已成为现代作物改良的关键工具。

1.2. CRISPR/Cas9技术的发现与发展

CRISPR序列于1987年在大肠杆菌中被首次发现，但其生物学功能在随后几年才逐渐被阐明。2002年，科学家正式提出CRISPR术语并鉴定出相关的Cas基因。2005年，研究提出CRISPR作为古菌细胞的遗传记忆，构成细菌和古菌的免疫系统。2007年，实验证实CRISPR和Cas基因赋予嗜热链球菌对噬菌体的抗性。2011年，发现了tracrRNA在crRNA成熟中的关键作用。突破发生在2012年，Charpentier和Doudna提出了可进行靶向DNA切割的CRISPR/Cas9系统设计。

2013年，该技术首次成功应用于植物（如水稻、本氏烟、拟南芥和小麦）和动物细胞，实现了特定基因的敲除。自此，CRISPR/Cas9的应用迅速扩展到多种园艺作物，包括番茄、马铃薯、柑橘、黄瓜、苹果、葡萄、香蕉、草莓、胡萝卜、猕猴桃、梨、板栗、一品红、玫瑰和油菜等，针对农艺性状进行改良。

2. 碱基编辑器的类型

2.1. 单碱基编辑器

第一代碱基编辑器基于CRISPR/Cas9系统，能够在不断裂DNA双链的情况下实现单碱基的精确替换。最常用的胞嘧啶碱基编辑器（CBE）利用胞嘧啶脱氨酶将胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），最终实现C·G到T·A的转换。随后开发的腺嘌呤碱基编辑器（ABE）使用工程化的腺嘌呤脱氨酶将腺嘌呤（A）转化为肌苷（I），实现A·T到G·C的转换。为了进一步扩展编辑范围，研究人员还开发了糖基化酶碱基编辑器，能够实现12种不同类型的碱基转换。

2.2. 双碱基编辑器

双碱基编辑器代表了基因组编辑的重要进展，它能在同一靶位点同时编辑两种不同的碱基。该系统整合了人胞嘧啶脱氨酶（hAID）和腺嘌呤脱氨酶以及Cas9变体（SpCas9 D10A突变体），允许同时进行C-to-T和A-to-G替换，从而提高了整体编辑效率。基于此概念开发的饱和靶向内源突变编辑器（STEME）可在特定基因组区域内引入更广泛的突变，有效产生与优良农艺性状相关的新等位基因。

2.3. 先导编辑器

先导编辑器（PEs）由切口Cas9（nCas9）与逆转录酶（RT）融合而成，并依赖一种称为先导编辑向导RNA（pegRNA）的特殊RNA分子。pegRNA既负责靶向定位，也携带了所需的编辑模板信息。该系统通过nCas9在靶位点产生切口，pegRNA的引物结合序列（PBS）与暴露的单链DNA结合，随后RT以pegRNA上的模板序列为模板合成新的DNA链。通过3′和5′ flap结构的动态转换及细胞修复机制，将所需的序列整合到基因组中，实现精准的碱基替换、插入或缺失。先导编辑器理论上能实现12种类型的碱基替换，大大扩展了精确基因组修饰的范围。

CRISPR/Cas系统的递送方式对其编辑效率、DNA整合风险及监管分类至关重要。常用的递送平台包括质粒DNA、mRNA和核糖核蛋白（RNP）复合物。质粒DNA通常通过农杆菌或基因枪递送，可实现稳定长期表达，但存在DNA整合和较高的脱靶风险，通常被视为转基因生物（GMO）。mRNA和RNP是瞬时表达系统，活性持续时间短，脱靶风险较低，且无DNA整合，通常被认为是非转基因的，更易于商业化。这些平台已在番茄、黄瓜、柑橘、葡萄、苹果、生菜等多种园艺作物中得到应用。

3. 碱基编辑器在园艺植物中的应用

多种碱基编辑器已成功应用于园艺植物，但其编辑效率存在显著差异。例如，在水稻、小麦和马铃薯中，利用Cas9切口酶与胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A（A3A-PBE）融合，介导了C-to-T转换。在四倍体马铃薯中，利用CRISPR/Cas9靶向敲除StGBSSI基因产生了直链淀粉缺陷突变体，而CBE则通过引入氨基酸改变来破坏基因产物的功能。在番茄和马铃薯中靶向ALS基因，实现了对磺酰脲类除草剂的抗性，编辑效率在番茄中高达71%。在油菜中，BnALS1基因P197位点的胞嘧啶向胸腺嘧啶的转换赋予了磺酰脲-甲基抗性。在番茄中，结合CRISPR/Cas9和激活诱导胞嘧啶脱氨酶（Target-AID）通过多轮碱基编辑引入了多点突变，产生了除草剂抗性。此外，通过碱基编辑还开发出了无标记且可遗传的番茄植株。

虽然碱基编辑和先导编辑比传统CRISPR/Cas9系统更精确，但它们在园艺物种中的实际应用仍处于起步阶段。碱基编辑效率相对较高，且设计简单，与现有转化系统兼容性好。先导编辑可引入更广泛的遗传修饰，包括插入和颠换，但其效率通常较低，构建体设计和递送系统更复杂，特别是在细胞周期长或基因组复杂的作物中，这些限制在再生困难和周期长的木本多年生植物中尤为突出。

3.1. 用于基因组和转录组调控的新兴CRISPR技术

除了基因组编辑，CRISPR技术的进步还实现了基因表达的可逆、精确调控以及RNA水平的编辑。

3.1.1. CRISPR干扰（CRISPRi）和激活（CRISPRa）

CRISPRi利用催化失活的Cas9（dCas9）融合转录抑制结构域，通过空间阻碍RNA聚合酶结合或招募染色质修饰复合物到靶基因启动子来抑制基因表达。相反，CRISPRa利用dCas9融合转录激活结构域（如VP64、VPR或p65）来增强靶基因的转录。这些系统能够实现可逆的、可编程的基因表达调控，且不引入双链断裂，在针对必需基因进行功能基因组学研究或性状调控时尤其有价值。CRISPRi已在本氏烟中成功用于抑制内源基因表达。在香蕉中，dCas9调控系统被用于微调抗病途径和延迟果实成熟。CRISPRa也被用于激活番茄等蔬菜作物中沉默或低表达的基因，为提高产量、胁迫耐受性和有价值代谢物生物合成提供了新机会。

3.1.2. RNA靶向与编辑：CRISPR/Cas13系统

CRISPR/Cas13是一种RNA引导的RNA靶向平台，允许在不改变基因组DNA的情况下进行瞬时、可逆的基因表达调控。Cas13具有可编程的RNase活性，能选择性结合并切割mRNA转录本。当与RNA编辑酶（如ADAR或APOBEC）结合时，Cas13可在转录水平促进精确的、位点特异性的碱基转换，如腺苷到肌苷（A-to-I）或胞苷到尿苷（C-to-U）编辑。这一特性对于需要时序控制的应用特别有价值，例如精细调控内源基因表达或抑制感染细胞中的病毒RNA。Cas13在抗击RNA病毒方面显示出巨大潜力，在水稻中已证明其有效性，为易感病毒园艺作物（如黄瓜和甜瓜）的应用带来了希望。

3.1.3. 遗传密码重编

遗传密码重编指通过多重CRISPR编辑策略对基因组进行大规模、系统性的密码子重新编码。这种方法涉及特异性密码子（如终止密码子）在基因组中所有出现位置的靶向替换，从而使得非经典氨基酸能够掺入植物蛋白质。这种重编不仅扩展了蛋白质的功能库，也为植物合成生物学开辟了新途径。其中一个有前景的应用是通过重新分配密码子来干扰病毒复制周期，从而开发抗病毒作物。此外，该技术有潜力改造出具有全新生物合成能力或增强胁迫抗性的作物。虽然遗传密码重编的进展主要在模式生物中实现，但最近的基因重编和tRNA再工程概念验证研究为在番茄和生菜等园艺作物中的应用奠定了基础。

3.2. CRISPR/Cas9在园艺作物基因工程中的应用

CRISPR/Cas9介导的八氢番茄红素脱饱和酶（PDS）基因敲除已成为验证园艺物种基因组编辑效率的通用策略。在黄瓜、甜瓜、南瓜等瓜类作物中，PDS disruption consistently produces albino phenotypes, confirming reliable editing outcomes. Similar results have been observed in fruit crops like apple and pear, as well as ornamentals such as lily (Lilium spp.), underscoring the utility of PDS as a visual marker across taxonomically diverse systems.

3.2.1. 植物生长特性

植物生长特性决定了作物的整体结构、发育和生产力。CRISPR/Cas9基因组编辑使得对控制植物生长的基因进行精确修饰成为可能，从而培育出半矮化品种、改良的花序结构、改变的叶片形态和优化的种子性状。例如，在香蕉中，通过编辑MaGA20ox2基因产生了半矮化品种。在番茄中，编辑DELLA基因（GA信号负调控因子）产生了具有紧凑结构的矮化植株。在观赏植物中，编辑矮牵牛的AN4基因导致花冠脉色素缺失，揭示了其在花色形成中的关键作用。在蓝莓中编辑CEN基因改善了营养品质。编辑矮牵牛的ACO1基因通过调节乙烯合成延长了花的寿命。

3.2.2. 开花性状

开花是植物关键的发育阶段。CRISPR/Cas9技术已被用于改变多个与开花相关的基因表达。在番茄中，FANTASTIC FOUR (FAF)基因家族成员是开花时间的重要决定因子。过表达SlFAF1/2a可促进早花和果实成熟。在矮牵牛中，敲除miR159b和PhACO1基因改变了花的生理特性，导致开花延迟和花期延长。CYC-like和RAD-like调控模块影响花对称性、花瓣形态和花冠色素。在蝴蝶草中，编辑TfRAD1和F3H基因导致了不同的花瓣形状和颜色变异。在日本牵牛花中，编辑DFR-B基因产生了不含花青素的白色花。敲除CCD4基因成功改变了花瓣颜色。在龙胆花中，编辑花青素生物合成基因产生了多种花色图案。

3.2.3. 果实品质

果实品质是影响消费者偏好和市场价值的基本性状。CRISPR/Cas9技术已被用于改良果实品质性状。在草莓中，敲除FaPG1基因显著提高了果实硬度。在灯笼果中，编辑SELF-PRUNING 5G基因促进了从营养生长到生殖发育的提早转换，改善了果实产量和品质。在黄瓜中，敲除CsHT16导致果实变短变粗，这是由于糖和激素稳态被打乱所致。在番茄中，敲除AGL6基因诱导了单性结实果实的形成。靶向MBP21基因阻止了果梗离层的形成，有利于机械采收。通过编辑番茄和草莓中的CRITOSO, MYB12, PSY1, RAP等基因，获得了橙色、粉色、黄色和白色等不同果色的果实。在香蕉中，敲除LCYε基因提高了β-胡萝卜素含量。编辑FvPHO2基因提高了磷含量，这与果实中糖积累正相关。操纵SlbZIP1基因导致番茄果实中糖和氨基酸积累增加。敲除成熟相关基因（如RIN, SlACS2, SNAC9）可延迟果实成熟。在马铃薯中，敲除St16DOX基因降低了有毒糖苷生物碱的含量。靶向突变SmelPPO基因减少了茄子和马铃薯的酶促褐变。

3.2.4. 生物和非生物胁迫抗性

CRISPR/Cas9技术已被用于提高多种植物的胁迫抗性。在苹果中，转移野苹果的火疫病抗性基因FB_MR5或沉默感病基因HIPM，显著降低了病害症状。在柑橘中，突变感病基因CsLOB1赋予了对柑橘溃疡病的抗性。在葡萄中，编辑VvWRKY52等基因增强了对灰霉病等多种病原菌的抗性。香蕉易感香蕉条纹病毒（BSV）和镰刀菌枯萎病，通过编辑内源BSV序列和敲除感病基因MusaDMR6，成功赋予了抗性。

近年来对瓜类作物的研究利用CRISPR/Cas9技术阐明了关键基因在非生物胁迫耐受性，特别是盐和干旱胁迫中的作用。在南瓜中，敲除CmCNIH1基因证实了其在促进Na⁺从地上部向根部再循环、增强耐盐性方面的作用。基因敲除分析表明，转录因子CmoNAC1通过调控CmoHKT1;1等基因，整合ABA和H₂O₂信号与离子稳态，增强嫁接黄瓜的耐盐性。CmoDREB2A与CmoNAC1相互作用，共同调控胁迫响应基因并维持K⁺/Na⁺平衡。在以南瓜为砧木的嫁接黄瓜中，CsHAK5;3介导K⁺吸收并在盐胁迫下维持离子平衡。基因敲除分析表明，质膜水通道蛋白CmoPIP1-4通过调节抗氧化反应和H₂S信号，有助于南瓜的耐盐和耐旱性。对Rboh基因功能的探索表明，CmCIPK1-CmRbohD1/D2复合物在盐胁迫下增强南瓜的早期活性氧（H₂O₂）信号和离子稳态。

在生物胁迫方面，CRISPR/Cas9也被用于提高瓜类和其他作物的抗病性。在西瓜中，靶向敲除Clpsk1显著增强了对尖孢镰刀菌的抗性。CRISPR/Cas9介导的Mlo1基因编辑提高了番茄和黄瓜对白粉病的抗性。在马铃薯中，编辑StCHLI和StDMR6-1增强了对晚疫病的抗性。在番茄中，编辑MAPK3基因改善了对灰霉病的抗性；编辑eIF4E基因产生了对多种植物病毒具有抗性的转基因植株。在番茄和草莓中，编辑MAPK3, SlCBF1, BZR1, SINPR1, FVICE1等基因赋予了对寒冷、干旱和高温等非生物胁迫的强耐受性。

4. 伦理关切与公众认知

基因组编辑技术，特别是CRISPR/Cas9，正在推动农业发生变革。然而，这些技术的广泛应用深受伦理考量、监管框架和公众认知的影响。伦理关切包括基因组修饰可能带来的意外生态后果、脱靶效应风险、小规模农户的公平获取、生物多样性保护以及对粮食系统的长期影响。一个重要的争议点在于基因组编辑作物的监管分类。尽管基因组编辑（尤其是无DNA编辑）与转基因生物存在技术区别，但监管政策仍不尽相同。欧盟采用基于过程的GMO指令，将所有基因组编辑生物视为转基因生物（GMO），无论是否含有外源DNA。这实施了严格的追溯、标签和环境风险评估规定，可能限制创新和商业化。相反，美国遵循基于性状的方法，许多基因组编辑产品（如SDN-1编辑）如果可以通过传统育种实现，则不受GMO法规监管。中国作为农业大国，近年来转向更支持的监管环境，将基因组编辑与转基因区分开来，并简化了审批流程，特别是对于不插入外源DNA的性状。这些不同的监管体系直接影响国际贸易、公众信任、研发投资和作物推广时间表，使得协调全球标准变得困难。

公众认知同样是市场接受度的决定性因素。研究表明，许多消费者对基因组编辑缺乏了解，并常常将其与传统转基因混淆，特别是在法规不明确和缺乏透明标签的情况下。态度的差异往往与文化、伦理和社会政治背景相关。最终，伦理接受度与科学完整性内在相关，特别是防止脱靶效应。使用高保真Cas9变体（如SpCas9-HF1, eSpCas9）、优化的sgRNA设计算法和预验证算法可以减少意外突变。尽管如此，通过全基因组测序、扩增子深度测序和生物信息学流程进行严格的编辑后验证，对于确认编辑特异性和确保生物安全至关重要。展望未来，承认基因组编辑安全性和潜力的、一致的国际化政策，以及积极主动的公众参与框架，对于将该技术伦理且可持续地融入全球粮食体系至关重要。

5. 未来展望

传统的园艺作物育种方法，尤其是果树育种，耗时且技术挑战大。CRISPR/Cas9技术的应用可以显著解决这些问题。在调控植物生长特性、改变开花时间和花色、改善果实品质、增强植物抗性方面已取得重大进展。尽管已为柑橘、葡萄、番茄等主要园艺作物开发了Cas9转化系统，但由于遗传信息不完整，许多其他物种的系统仍有待开发。在园艺植物中使用CRISPR/Cas9系统进行基因修饰仍面临巨大挑战，包括编辑效率低和脱靶效应导致的意外遗传修饰。编辑成功率受物种特异性基因组背景、染色质可及性、sgRNA设计、启动子选择和递送方法影响。因此，协议标准化和作物特异性优化仍是首要任务。

未来，改进不依赖基因型的转化方案对于扩展基因组编辑至多样化园艺种质资源至关重要。利用发育调节因子（如WUSCHEL, BABY BOOM）促进再生，或将核糖核蛋白直接递送到分生组织等策略，为克服基因型依赖性提供了有前景的途径。针对特定作物物种定制递送系统，以及开发无需组织培养的基因组编辑系统，可能缓解当前瓶颈，实现对优良商业品种的编辑。

基因组编辑策略还应考虑一年生和多年生园艺作物在生物学和发育上的差异。多年生植物（如苹果、葡萄、柑橘）因其幼年期长、多倍体基因组和再生困难而带来独特挑战，这会延迟编辑表型的获得和评估。相反，番茄和生菜等一年生作物世代时间短、再生能力强，允许进行更多轮次的转化和性状验证。因此，针对多年生作物的编辑系统必须优先考虑效率、分生组织的稳定转化以及降低体细胞克隆变异以保持品种真实性。整合可移动RNA递送、编辑砧木嫁接和早花基因盒等是正在研究的有前景的解决方案。

基于目前已获得的重要性状突变株系，单碱基编辑器、双碱基编辑器和先导编辑器可应用于园艺植物。然而，不同的编辑技术会产生不同的结果，应根据具体的园艺植物来确定。最近，转座酶辅助靶位点整合（TATSI）系统成为一种新方法，它结合了CRISPR/Cas9诱导的断裂和转座酶介导的插入，以实现精确的、位点特异性的基因整合。TATSI已在拟南芥和大豆中证明了高插入准确性和完整的货物递送能力，为植物靶向基因组工程提供了有前景的替代方案。尽管CRISPR/Cas9技术仍面临挑战，但其在农业中的变革潜力是毋庸置疑的。基因编辑时代已经开启，这项技术必将引领农业及其他行业未来的飞速发展。