揭示胞外囊泡分子网络在牙周炎发病机制中的关键作用

《International Dental Journal》：Uncovering the Molecular Networks of Extracellular Vesicles in the Pathogenesis of Periodontitis

本研究针对牙周炎靶向治疗需求，整合bulk RNA-seq、单细胞RNA-seq及因果遗传分析，系统性鉴定出9个因果性胞外囊泡相关基因（ERGs），构建了XGBoost诊断模型（AUC=0.836），发现地塞米松可通过结合HSPB1发挥治疗潜力，为牙周炎的精准诊疗提供了新策略。

　　

牙周炎是一种影响全球约5.38亿人的慢性炎症性疾病，其特征是细菌生物膜积累、牙龈炎症、结合上皮向根方迁移、结缔组织附着丧失以及牙槽骨吸收。虽然传统的牙周炎治疗方法（如洁治刮治、抗生素治疗和口腔抗菌剂）在短期内能有效减少微生物负荷并缓解临床症状，但这些非选择性方法可能带来长期全身和口腔副作用的风险。因此，开发更具靶向性和高效的治疗方法迫在眉睫。

胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs），尤其是外泌体（exosomes），是大多数细胞类型在生理和病理条件下释放的纳米级细胞外囊泡（直径30-150纳米）。它们持续通过胞吐作用分泌并被受体细胞内化，通过转移功能性miRNA等生物活性分子介导细胞间通讯。由于其低免疫原性、高递送效率、炎症调节特性以及穿越血脑屏障等生物屏障的能力，外泌体日益被认为是基因治疗和药物递送的有前景的天然纳米载体。研究表明，牙髓干细胞来源的外泌体可以调节牙周膜干细胞中的抗炎和成骨作用；M2巨噬细胞来源的外泌体中工程化褪黑素可介导内质网应激和免疫重编程用于牙周炎治疗。然而，尽管大量研究调查了牙周炎与潜在生物标志物或治疗靶点之间的关系，证明了各种生物标志物和靶点的参与，但大多数研究采用的方法有限。有些仅专注于单细胞测序或孟德尔随机化，而其他研究仅结合了单细胞和bulk RNA-seq分析。迄今为止，很少有研究系统性地整合这些多组学方法来全面探索牙周炎的生物标志物和治疗靶点，特别是与外泌体相关的靶点。此外，外泌体在牙周炎发病机制中的具体作用——包括外泌体相关基因的识别及其下游调控效应——仍有待充分阐明。

为此，重庆医科大学口腔医学院的研究团队在《International Dental Journal》上发表了一项研究，旨在通过整合大规模bulk RNA-seq和单细胞RNA-seq数据，结合外泌体相关基因（ERG）分析，探索与牙周炎风险相关的基因，并揭示这些基因在牙周炎发展中的潜在作用。通过应用基于摘要数据的孟德尔随机化（SMR）分析、功能富集分析和机器学习模型，识别出与牙周炎相关的候选基因，从而为牙周炎的早期诊断、疾病机制研究和潜在治疗靶点提供了新的见解。

研究人员运用了多项关键技术方法。他们从GEO数据库获取了牙周炎的bulk RNA-seq数据集（GSE10334、GSE16134等作为训练集和验证集）以及单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据集（来自牙周炎患者牙龈组织的GSE164241、外周血的GSE174679以及糖尿病合并牙周炎患者外周血的GSE244515）。通过文献和GeneCards数据库筛选了外泌体相关基因（ERGs）。利用Limma包进行差异表达基因（DEGs）分析，并应用基于摘要数据的孟德尔随机化（SMR）分析来推断ERGs与牙周炎之间的因果关系。通过DSigDB数据库进行药物重定位预测，并利用CB-Dock2平台进行分子对接验证。采用包括Lasso、XGBoost、随机森林等在内的12种机器学习算法构建诊断模型，并通过十折交叉验证进行优化。使用MCP-counter、CIBERSORT和xCell算法进行免疫细胞反卷积分析。利用"clusterProfiler"包进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，并通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。对scRNA-seq数据使用Seurat包进行质控、标准化、降维和聚类，并通过AUCell、UCell、singscore和GSVA等多种算法进行整合评分。应用CellChat工具分析细胞间通讯网络，并使用Monocle包进行伪时间轨迹分析。最后，利用Scissors算法整合bulk和单细胞数据，识别与表型相关的细胞亚群。

数据预处理和牙周炎致病基因的识别

生物信息学分析在牙周炎训练队列中识别出2968个显著差异表达基因（DEGs），其中1355个上调，1613个下调。这些DEGs与外泌体相关基因数据库和SMR基因集取交集后，最终确定了9个可能通过外泌体介导机制参与牙周炎发病的关键基因。其中6个基因上调（CD34、TLR4、TIMD4、ENPP4、HLA-DRA和HLA-B），另外3个基因下调（ENDOD1、PSMA4和HSPB1）。SMR分析结果显示，CD34、HLA-DRA、HSPB1、PSMA4、TIMD4和ENDOD1与牙周炎风险呈负相关，而ENPP4、HLA-B和TLR4与牙周炎风险呈正相关。

治疗潜力评估

利用DSigDB数据库预测潜在治疗化合物，根据地塞米松成为最显著的候选药物，其靶点包括ENDOD1、HLA-DRA、HSPB1和TLR4。其他有前景的化合物包括卡非佐米、硼替佐米和甲苯胺蓝。分子对接分析显示，地塞米松与HSPB1的结合能最低（-10.7 kcal/mol），表明形成了高度稳定的复合物。

基于机器学习的牙周炎关键诊断基因识别

采用包含12种算法和十折交叉验证的集成机器学习框架，构建了一个基于9个共享基因的稳健诊断模型。在处理后的训练队列和独立外部验证数据集上的分析表明，包含所有9个基因的XGBoost算法实现了最高的诊断性能，使其成为牙周炎诊断最有效的模型。

反卷积分析揭示牙周炎中特征性免疫细胞浸润模式

通过整合三种计算反卷积算法（CIBERSORT、MCP-counter和xCell），研究人员表征了牙周炎患者牙龈组织中免疫-血管-基质网络的显著重塑。分析显示：（1）B淋巴细胞和浆细胞的显著富集，以及滤泡辅助性T细胞（Tfh）的增加，表明存在持续的抗原特异性免疫应答；（2）静息树突状细胞、中性粒细胞和单核/巨噬细胞谱系的显著浸润，表明先天免疫的积极参与；（3）内皮细胞的显著改变和StromaScore的升高，表明广泛的细胞外基质（ECM）重塑和病理性血管生成。

外泌体相关基因在牙周炎中的调控

对关键外泌体功能相关基因的综合分析显示，基因本体（GO）富集分析表明这9个关键基因显著富集于抗原加工和呈递、MHC蛋白复合物和抗原结合。KEGG通路分析显示了抗原加工和呈递、细胞粘附分子和吞噬体通路的显著富集。PPI网络分析确定了10个显著的相互作用，其中HSPB1和HLA分子作为中枢节点。关键的相互作用对如TLR4–HLA-DRA和CD34–ENPP4表明外泌体可能在疾病进展过程中协调免疫激活和血管重塑。

整合多算法评分进行差异基因表达分析

为了表征与关键基因上调相关的细胞景观，研究人员进一步分析了单细胞转录组数据。数据预处理和细胞亚群聚类后，UMAP投影显示了免疫细胞亚型的明显聚类。使用4种不同的计算算法评估了6个上调基因在所有注释的细胞亚群中的表达谱。这些方法的平均得分显示，这些基因在B细胞、单核细胞和髓系树突状细胞（mDCs）中显著上调，与之前的反卷积分析结果一致。

细胞通讯分析

为了阐明外泌体相关基因在牙周炎炎症微环境中的细胞间通讯作用，选择了9个与外泌体生物发生和信号传导相关的关键基因作为靶配体或受体。基于三个单细胞转录组数据集中的配体-受体相互作用网络进行了系统分析。在牙周炎患者的牙龈组织中，涉及CD34–SELP和SELL–CD34/SELL–PODXL的外泌体介导的信号通路显著富集。进一步的比较分析表明，MHC II类（MHC-II）通路在牙周炎患者和2型糖尿病牙周炎患者的外周血单核细胞（PBMCs）中均显著激活。然而，合并症组独特地表现出MHC I类（MHC-I）通路的激活，表明代谢疾病诱导的牙周免疫微环境重塑。

牙周炎和合并糖尿病中ERGs的伪时间动力学

为了在单细胞分辨率下进一步探索外泌体相关关键基因的动态表达模式，使用Monocle对牙周炎患者牙龈组织scRNA-seq数据进行了伪时间轨迹分析。在仅患牙周炎患者的内皮细胞中，HSPB1和HLA-B的表达在细胞发育后期显著上调，而CD34、PSMA4、TLR4和ENDOD1则沿着轨迹逐渐下调。为了比较仅患牙周炎和糖尿病相关牙周炎患者之间的表达动力学，研究人员进一步关注了NK细胞和CD8⁺ T细胞。在仅患牙周炎患者的NK细胞中，TIMD4和TLR4在早期阶段上调，而HLA-DRA、HSPB1、HLA-B和PSMA4在后期阶段增加。相比之下，在2型糖尿病牙周炎组中，HLA-B和PSMA4的表达在后期阶段显著下调。对于CD8⁺ T细胞，HSPB1在仅患牙周炎患者的早期阶段显著上调，而在2型糖尿病牙周炎患者中，HSPB1的上调发生在后期阶段，TLR4则呈现相反的趋势。

整合bulk和单细胞数据

为了整合bulk RNA-seq结果与单细胞转录组数据，研究人员采用了Scissors算法（单细胞识别与批量样本表型相关的亚群）。该方法识别了单细胞数据中与批量样本中观察到的表型差异最相关的细胞亚群。将其应用于牙周炎数据集，发现B细胞和内皮细胞显著富集，单核细胞和成纤维细胞存在次级聚类。

研究结论与讨论部分指出，本研究全面探讨了ERGs与牙周炎及其主要并发症之间的因果关系。经过多重检验后，9个与牙周炎显著相关的ERGs被纳入后续分析，并从多个角度分析了ERGs在牙周炎中的功能。

Toll样受体4（TLR4）通过识别牙周炎患者龈下微生物群中丰富的革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS），在先天免疫中发挥关键作用。TLR4的激活会触发下游炎症信号级联反应，包括NF-κB通路，导致促炎细胞因子的产生，从而促进牙周组织破坏。本研究显示TLR4与牙周炎风险呈正相关，支持其作为牙周炎炎症过程中宿主-微生物相互作用的关键介导者的潜在作用。

人类白细胞抗原（HLA）基因，特别是I类和II类基因，可能通过影响抗原特异性T细胞反应来影响牙周炎。本研究确定了HLA-B（I类）和HLA-DRA（II类）与牙周炎显著相关，这进一步支持了HLA系统的两个分支都有助于宿主免疫反应的个体差异，并可能影响患牙周炎的风险。

CD34是一种广泛表达于造血干细胞/祖细胞和循环内皮祖细胞（EPCs）的糖基化跨膜蛋白。在糖尿病相关牙周炎中，CD34⁺细胞水平高于全身健康个体。本研究结果显示CD34与牙周炎风险呈负相关。鉴于先前研究结果与本研究结果的不一致，需要进一步的实验研究来阐明CD34在牙周炎发病机制中的作用。

外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ENPPs，也称为CD203家族）是表达在细胞表面的I型或II型跨膜蛋白。先前研究已将ENPP家族成员与炎症性肠病和癌症联系起来。尽管目前没有直接证据支持ENPPs在牙周炎中的作用，但本分析表明ENPP表达与牙周炎风险呈正相关。

热休克蛋白β-1（HSPB1）已知通过限制铁诱导的脂质ROS产生来抑制铁死亡，与牙周炎的进展有关。在本研究的差异表达和SMR分析中，HSPB1与牙周炎风险呈负相关。

PSMA4是蛋白酶体复合物的一个亚基，该复合物包含19S调节颗粒和20S核心颗粒，对蛋白质降解至关重要。新兴证据表明PSMA4可能通过调节炎症通路参与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的发病机制。此外，与健康受试者相比，有并发症的1型糖尿病（T1D）患者中观察到较低的PSMA4表达。在本研究中，基于DEGs和SMR分析，PSMA4与牙周炎风险呈负相关。

TIMD4是一种主要表达于抗原呈递细胞的磷脂酰丝氨酸受体，与免疫相关疾病有关。单细胞分析显示，TIMD4通过p38 MAPK通路调节CD301b⁺巨噬细胞，其缺失会加重牙周炎中的牙槽骨丧失。这与本研究发现的TIMD4与牙周炎风险降低相关的结果一致。

ENDOD1是一种具有预测的DNA/RNA核酸酶结构域的蛋白质，与RNF26形成复合物，通过cGAS–STING通路调节先天免疫信号。由于先天免疫主要参与牙周炎的发病机制，ENDOD1可能通过调节该通路促进疾病进展。在本分析中，ENDOD1与牙周炎风险呈负相关，表明其在牙周免疫调节中的潜在作用。

单细胞测序分析显示，这些基因不仅在牙周炎患者的外周血中发挥重要作用，而且在牙周炎牙龈组织的病理机制以及糖尿病相关牙周炎患者的外周血中也发挥作用。伪时间分析显示HSPB1在晚期内皮细胞、CD8⁺ T细胞和NK细胞中上调，而SMR在遗传水平上指示其保护作用。这种上调可能反映了炎症微环境中特定细胞亚群的一种应激反应、抗凋亡机制。

研究人员观察到某些基因，如TIMD4、CD34和HLA-DRA，在SMR分析中显示出保护作用，但在牙周炎患者的牙龈组织中上调。这种表面上的不一致可以通过这些方法捕获的不同生物学水平来解释：SMR反映了对疾病的遗传易感性，而DEG分析代表了疾病条件下的转录状态。因此，保护性基因的上调可能表明旨在恢复免疫平衡、促进组织修复或限制炎症的代偿性或修复性反应，而不是增加疾病风险。

在本研究中，地塞米松通过与这些外泌体相关基因（ERGs）的相互作用，成为治疗牙周炎的最有希望的候选药物，分子对接结果显示了强大的结合亲和力，支持其治疗潜力。这一发现得到了先前研究的支持，这些研究强调了地塞米松在调节炎症反应和促进牙周愈合中的关键作用。

本研究的优势在于利用了SMR因果推断方法，该方法能够在遗传水平上筛选具有潜在致病作用的关键基因，从而提高了靶点筛选的精确性和可靠性。此外，通过结合功能富集分析和构建PPI网络，能够揭示候选基因在免疫调节、炎症反应和组织重塑等核心生物学通路中的功能作用，从而提高了研究的生物学解释力。另外，通过药物预测和分子对接分析，建立了基因-药物作用桥梁，为后续靶向干预提供了可行的候选分子，突出了研究结果的临床转化潜力。机器学习模型（如LASSO、随机森林和SVM）的引入进一步增强了识别高通量数据中关键特征的能力，提高了结果的稳定性和可解释性。最后，在单细胞分析中使用CellChat、Monocle和Scissors等先进算法，使得能够从细胞通讯、疾病轨迹和关键细胞识别等多个角度探索牙周炎的发病机制，从而在细胞水平提供了精确分析。

该研究可能存在一些局限性。虽然细胞通讯和外泌体是牙周炎复杂机制的一个关键方面，但本研究主要关注外泌体相关基因（ERGs），可能忽略了与牙周炎相关的其他潜在生物标志物和治疗靶点。此外，外泌体与某些细胞通讯通路之间的相互作用或重叠可能使一些已识别ERGs的解释复杂化，这些基因不一定参与外泌体的生物发生或功能。这些机制需要进一步的实验验证来确认其相关性。而且，某些候选生物标志物，如CD34和HLA-DRA，被发现与牙周炎相关，但与本研究的不同分析（如DEGs和SMR）存在不一致，表明该领域存在持续争议，需要更多研究来澄清。另一个局限性是未发现经典的外泌体核心成分基因（例如EXOSC10、EXOSC3、EXOSC5）与牙周炎有显著关联，这可能指向当前分析策略或数据集敏感性的局限性。此外，疾病调控的复杂性，包括DNA甲基化、可变剪接和翻译后修饰等因素，表明未来需要通过整合多组学方法来评估ERGs的预测和治疗潜力。最后，需要来自牙周炎患者牙龈组织和外周血的额外高分辨率单细胞转录组数据集，以验证ERGs在局部和全身背景下的表达模式和功能作用。

总之，这项整合了多组学层数据并应用多种分析方法的研究，识别出几个可能与牙周炎风险和发病机制相关的外泌体相关基因（ERGs）。基于富集分析、相互作用网络和免疫相关性的功能分析进一步突出了它们潜在的生物学作用。然而，需要进一步的实验验证和临床队列研究来确认这些候选基因作为牙周炎诊断生物标志物和治疗靶点的可靠性、功能相关性和转化潜力。