基于信息素结合蛋白PBP2的电化学阻抗生物传感器动态监测茶尺蠖活体雌蛾研究

《Advanced Sensor and Energy Materials》：Dynamic detection of live female tea geometrid moths using an olfactory electrochemical impedance biosensor based on pheromone-binding protein

本研究针对茶园茶尺蠖雌蛾种群动态监测难题，开发了一种基于雄性茶尺蠖信息素结合蛋白2（PBP2）的嗅觉电化学阻抗生物传感器。该PBP2生物传感器可特异性结合两种性信息素组分（Z3Z9-6,7-epo-18:Hy和Z3Z6Z9-18:Hy），检测范围10?7-10?4 M，并成功实现活体雌蛾动态检测。研究通过分子对接识别关键氨基酸残基，建立检测信号数学模型，为害虫活体监测提供新技术方案。

　　

在茶园生态系统中，茶尺蠖（Ectropis obliqua）是一种危害严重的鳞翅目害虫，其幼虫嗜食茶树嫩叶和嫩芽，可在短时间内对茶园造成重大经济损失。传统上，对鳞翅目昆虫（包括茶尺蠖）的监测通常通过性信息素诱饵吸引和诱捕雄蛾来实现。然而，茶尺蠖的爆发通常始于雌蛾，每只雌蛾交配后平均可产卵200粒，且其产卵地点决定了幼虫的孵化场所。因此，对茶尺蠖雌蛾种群的检测和动态监测对于茶园的保护和安全显得更为关键。现有的监测技术存在局限性，无法直接、动态地监测活体雌蛾的活动，这阻碍了早期预警和精准防控。

为了解决这一难题，一项发表在《Advanced Sensor and Energy Materials》上的研究开辟了新途径。不同于常见的利用性信息素诱捕雄蛾的策略，研究人员将目光投向了雄性茶尺蠖自身用于探测雌蛾性信息素的“分子钥匙”——信息素结合蛋白2（Pheromone-Binding Protein 2, PBP2）。PBP是昆虫触角嗅觉淋巴中高丰度存在的一类小分子分泌球蛋白，在昆虫嗅觉识别中扮演着“分子搬运工”的角色，负责将疏水性的性信息素分子运输穿过水溶性淋巴，抵达嗅觉感觉神经元树突膜上的气味受体。利用PBP对特定性信息素的高亲和力和特异性结合能力，将其作为生物识别元件构建生物传感器，为直接检测雌蛾释放的性信息素、进而实现活体雌蛾的动态监测提供了全新的理论和技术可能性。

本研究旨在开发一种基于茶尺蠖PBP2的电化学阻抗生物传感器，并评估其特异性、灵敏度以及动态监测活体茶尺蠖雌蛾的能力。研究还通过分子对接预测了PBP2与性信息素结合的关键氨基酸位点，并基于检测信号建立了活体雌蛾数量的数学模型，为未来田间应用奠定基础。

为开展此项研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术方法：首先，利用分子生物学技术（原核表达系统pET-32a(+)/BL21(DE3)）表达并纯化了茶尺蠖重组PBP2蛋白。其次，将纯化的PBP2蛋白通过物理吸附法固定于涂覆有硝化纤维素（Nitrocellulose, NC）膜的叉指金电极表面，构建了PBP2生物传感器。第三，采用电化学阻抗谱（Electrochemical Impedance Spectroscopy, EIS）技术，以电荷转移电阻（R_ct）和标准化阻抗变化（Normalized Impedance Change, NIC）为主要参数，定量分析了PBP2传感器与不同浓度性信息素组分（Z3Z9-6,7-epo-18:Hy和Z3Z6Z9-18:Hy）及植物挥发物nerolidol的结合特性。第四，利用分子对接软件（Molegro Virtual Docker）模拟了PBP2与配体分子的结合模式与关键氨基酸残基。最后，设计了一套包含气体分子收集管和富集管的活体雌蛾性信息素收集装置，对实验室饲养的茶尺蠖处女雌蛾（样本来源：杭州茶园）释放的性信息素进行了动态实时监测，并基于检测数据建立了数学模型。

3.1. 重组PBP2蛋白的表达与纯化

研究人员成功表达并纯化了茶尺蠖PBP2重组蛋白。SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析显示，目的蛋白条带清晰，分子量约为35 kDa，纯度高于90%，浓度经Bradford法测定为1.464 mg/mL，满足后续生物传感器构建的要求。

3.2. 生物传感器的制备与性能测试

通过将PBP2蛋白固定于NC膜修饰的叉指金电极上，成功制备了PBP2生物传感器。电化学阻抗谱表征显示，裸电极的阻抗半圆直径最小，修饰NC膜后阻抗显著增加，进一步固定PBP2蛋白后，电荷转移电阻R_ct值进一步增大，表明PBP2已成功固定于电极表面，并对电子转移产生了明显的空间位阻效应。

3.3. 信息素组分和气味物质的阻抗传感检测

性能测试结果表明，该PBP2生物传感器能够有效检测茶尺蠖性信息素组分。随着Z3Z6Z9-18:Hy浓度的增加（10^?7 至 10^?4 M），阻抗谱中的电子转移阻力显著下降。选择R_ct作为检测参数，并定义标准化阻抗变化NIC = [R_ct(空白) - R_ct(配体)] / R_ct(空白)。PBP2传感器对两种性信息素组分Z3Z6Z9-18:Hy和Z3Z9-6,7-epo-18:Hy均表现出良好的线性检测范围（10^?7 至 10^?4 M），线性方程分别为NIC = 0.1836 logC + 1.539 (R2 = 0.9542) 和 NIC = 0.1506 logC + 1.102 (R2 = 0.9417)，最大R_ct变化分别达50%和40%。相比之下，对植物挥发物nerolidol的响应其线性方程的斜率和R2值均较低，表明该传感器对性信息素组分具有良好的选择性。

3.4. 分子对接分析

分子对接预测揭示了PBP2与性信息素结合的结构基础。PBP2与Z3Z6Z9-18:Hy和Z3Z9-6,7-epo-18:Hy的结合空穴位于蛋白质三维结构的一侧，关键氨基酸残基Lys6、Ser7和Asn11可能在结合过程中起重要作用。其中，PBP2与Z3Z9-6,7-epo-18:Hy在结合空穴内可形成氢键，而与Z3Z6Z9-18:Hy则无氢键形成。两种性信息素组分的对接得分分别为-37.1257和-90.5851。而植物挥发物nerolidol与PBP2的结合位点与性信息素组分不同，这从结构上解释了PBP2传感器对性信息素的选择性。

3.5. 活体茶尺蠖雌蛾的动态检测

研究成功利用PBP2生物传感器对4头活体茶尺蠖处女雌蛾释放的性信息素进行了长达120分钟的动态监测。随着检测时间的延长，传感器阻抗逐渐下降，NIC值持续升高，表明雌蛾释放的性信息素在传感器表面不断被PBP2捕获和积累。与空白对照（新鲜空气）和阴性对照（新鲜茶叶）相比，活体雌蛾检测组的NIC值增长最为显著，且在90分钟后仍持续上升，而对照组的NIC值趋于稳定。根据标准曲线推算，120分钟时检测溶液中Z3Z6Z9-18:Hy和Z3Z9-6,7-epo-18:Hy的浓度分别为1.05 × 10^?7 M和2.45 × 10^?6 M，均落在传感器的线性检测范围内。

3.6. 茶尺蠖活体监测的数学模拟

为了将传感器检测信号与实际雌蛾数量关联，研究引入了校正系数K，定义为K = (-lgC) / n，其中C为两种性信息素组分的总浓度，n为雌蛾数量。通过监测不同时间点（10-120分钟）4头雌蛾的动态检测数据，建立了校正系数K与检测时间x（以10分钟为单位）的关系：对于Z3Z9-6,7-epo-18:Hy，K = -0.011x + 2.263 (R2 = 0.9710)；对于Z3Z6Z9-18:Hy，K = -0.011x + 2.413 (R2 = 0.9710)；对于两种性信息素组分总和，K_total = -0.011x + 2.238。最终推导出通过检测信号计算雌蛾数量的数学模型：n = (N_r - N_n - 1.641) / (-0.0019x + 0.377)，其中N_r为生物传感器检测的总NIC值，N_n为阴性对照的NIC值，x为检测时间。

本研究首次成功将昆虫PBP（特别是对性信息素具有高特异性的PBP2）应用于活体害虫的动态监测。与结合谱较广的普通气味结合蛋白（General Odorant-Binding Proteins, GOBPs）相比，PBPs因其对同种雌蛾释放的性信息素具有高度特异性，是构建靶向性害虫监测嗅觉生物传感器的理想识别元件。研究所采用的基于NC膜固定PBP2蛋白的方法，通过物理吸附保持了蛋白结构的稳定性，且成本低廉，有利于未来田间应用。所构建的传感器不仅实现了对合成性信息素组分的高灵敏度、高选择性检测，更重要的是突破了传统生物传感器仅检测化学分子的局限，实现了对活体昆虫的直接、动态监测，并建立了可靠的数学模型将检测信号量化为害虫数量，为精准农业和害虫综合治理提供了强有力的新工具。

尽管茶尺蠖中存在多个PBP成员，以及对其性信息素具有更强感知特异性的气味受体OR1，但作为七次跨膜蛋白，ORs的功能性体外重构及其在生物传感器中的应用面临巨大挑战。相比之下，PBP2蛋白易于表达纯化，稳定性好，基于其构建的生物传感器更易于实际开发和推广应用。该研究标志着害虫监测策略从间接诱捕雄蛾向直接探测雌蛾的重要转变，为开发基于PBPs的其他害虫监测传感器开辟了道路，极大地推动了生物系统工程在植物保护和农业环境领域的应用。未来，便携式PBP生物传感器有望在茶园等田间环境中实现对雌蛾种群的真实、实时监测与早期预警，对保障茶叶安全生产具有深远意义。