含有2′氟基和2′叠氮基修饰的混合XNA聚合物的酶促合成

《ACS Omega》：Enzymatic Synthesis of Mixed XNA Polymers Containing 2′Fluoro and 2′Azide Modifications

XNA聚合酶合成混合2'-azide/2'-fluoro修饰核酸并开发高效逆转录扩增方法。通过优化反应条件，验证SFM4-3、SFM4-6和SFP1可准确合成含2'-azide和2'-fluoro的混合XNA（如Az-A/F-CGT、Az-C/F-AGT），且合成保真度优于传统方法。建立一锅式逆转录扩增体系，利用Q5聚合酶实现2'-F/Az-XNA的高效DNA回译，误差率降低至1.5×10?2 epbp以下。该方法简化流程，缩短时间，适用于开发新型XNA aptamer和催化剂。

　　
人工核苷酸酸（XNA）作为生物技术领域的创新工具，因其耐核酸酶降解和可修饰非天然功能基团等特性备受关注。近期研究聚焦于含2'-azide（2'-Az）和2'-fluoro（2'-F）修饰的XNA聚合物的合成与转化技术，旨在拓展其在精准医疗和分子诊断中的应用潜力。该研究系统评估了XNA聚合酶的合成能力，并建立了高效的反向转录体系，为开发多功能XNA分子提供了关键技术支持。

XNA的合成依赖于工程化DNA聚合酶的改造。研究团队筛选了七种XNA聚合酶，发现SFM4-3、SFM4-6和SFP1三种酶在2'-Az与2'-F共存的混合体系中表现出最佳合成效率。通过调整核苷酸浓度（2'-Az NTP浓度100 μM，2'-F NTP浓度25 μM），有效抑制了脱氧核苷酸向核糖核苷酸的读穿效应。值得注意的是，该合成体系可在不含锰离子和低酶浓度（20 nM）条件下完成，为实验室操作提供了便利。

在合成产物结构多样性方面，研究成功制备了三种典型混合XNA：Az-A/F-CGT、Az-C/F-AGT和Az-G/F-ACT。其中，Az-A/F-CGT通过2'-Az-ATP与2'-F-CTP、2'-F-GTP、2'-F-TTP的共聚实现，合成产物长度达100bp。特别值得关注的是，该体系可兼容核糖核酸（RNA）的合成，通过替换dNTP为rNTP成功制备了Az-A/rCGU RNA分子，拓展了XNA的应用场景。

反向转录技术方面，研究建立了Q5 DNA聚合酶介导的一步法转化体系。通过优化反应条件（SF缓冲液、37℃热块处理），将XNA→DNA的转化效率提升至ΔCq值>9，较传统分步法（Superscript III逆转录+Q5扩增）节省约12小时。该体系成功将含2'-Az和2'-F修饰的XNA转化为高纯度DNA，测序显示其碱基匹配度达75-78%，误差率控制在7.4×10?3 epbp，接近商业DNA合成标准。

误差分析揭示了核苷酸浓度失衡对合成准确性的影响。当2'-Az NTP浓度显著高于2'-F NTP时（4:1比例），A、C、G对应的碱基错误率分别降低18%、23%和27%。然而，T碱基的误读率上升了12%，这可能与ATP的2'-Az修饰导致dTTP竞争性抑制有关。研究特别指出，Az-U/F-ACG体系存在转化瓶颈，需探索新型逆转录酶（如Superscript III或SFM4-9）突破尿嘧啶修饰的读取障碍。

应用前景方面，该技术为开发多功能XNA分子提供了平台。例如，在靶向药物递送系统中，2'-Az修饰可引入生物正交点击化学位点，而2'-F修饰则增强抗核酸酶稳定性。研究团队已验证该体系可成功合成含FANA（2'-氟-阿拉伯糖核苷酸）的XNA，为开发具有类核糖结构特征的分子探针奠定基础。

技术革新体现在三个方面：首先，建立标准化实验流程，包括合成条件（2h反应、40nM酶浓度）、产物纯化（Zymo DNA Clean Kit）和定量分析（Qubit浓度测定）；其次，开发高通量测序（HT-Seq）与定制分析脚本，实现百万级 reads 的快速处理与误差谱分析；最后，创建酶数据库（含32种已验证XNA聚合酶基因型），为研究者选择适配酶系提供参考。

当前挑战主要在于尿嘧啶类修饰的转化效率不足，以及高浓度2'-Az NTP导致的链终止异常。研究建议采用梯度浓度法（从100 μM逐步降低至25 μM）平衡合成效率与准确性。对于临床转化，需进一步验证含2'-Az/XNA杂合体的核酸在体内代谢稳定性，并优化商业酶的适用浓度。

该研究的重要突破在于构建了闭环XNA技术体系：从初始模板DNA出发，经XNA聚合酶合成混合修饰产物，再通过Q5聚合酶逆转录扩增，最终获得高保真DNA克隆。这种循环技术可应用于基因编辑中的精准碱基替换，例如通过2'-Az标记位点的点击化学偶联实现特定核苷酸的定向突变。

未来发展方向包括：（1）开发多酶联用系统，集成XNA合成与直接逆转录功能；（2）构建XNA-聚合物复合载体，利用2'-Az点击位点实现药物-基因协同递送；（3）探索硫代磷酸酯修饰与2'-Az共存的XNA体系，提升双链稳定性。这些创新将推动XNA在纳米医学、分子计算等前沿领域的应用。

该研究的技术细节已开源共享，包括反应条件优化方案（附件S2）、酶基因型对照表（附件S1）和测序分析脚本（GitHub链接）。特别值得关注的是，研究团队提供的SFP1酶在合成含2'-Az的RNA时展现出98.7%的序列保真度，为开发mRNA疫苗载体中的精准修饰提供了新工具。同时，建立的标准误差谱数据库（附件S9）可帮助研究者快速评估不同XNA合成体系的可靠性。

在产业化路径上，研究建议分三阶段推进：（1）优化现有XNA聚合酶的工业级反应条件（如移除热块保温装置，采用连续搅拌反应器）；（2）开发基于表面等离子体共振（SPR）技术的实时监测系统，实现合成过程的动态调控；（3）构建XNA合成-逆转录模块的自动化流水线，兼容96孔板高通量筛选。这些改进将使XNA合成成本降低至传统核苷酸合成的1/5以下。

当前研究尚未解决的三个关键问题：（1）2'-Az修饰对聚合酶热稳定性的影响机制；（2）不同酶系在复杂混合体系中（如4种以上修饰核苷酸）的协同作用规律；（3）含2'-Az的XNA在体内代谢动力学特征。这些研究方向的突破将彻底改变XNA作为生物材料的应用范式。

总体而言，该研究不仅完善了XNA合成技术谱系，更构建了从合成到检测的完整技术闭环。其创新价值体现在三个方面：首先，建立首套混合修饰XNA的标准化合成流程；其次，开发商业化酶系兼容的一步式逆转录扩增体系；最后，揭示核苷酸浓度梯度对合成准确性的调控规律。这些成果为开发新一代核酸靶向药物（如含2'-Az的siRNA载体）和诊断探针提供了关键技术支撑，预计将在五年内推动至少三个XNA相关药物进入临床前研究阶段。