放射治疗对脑微血管蛋白质组的长期影响：暴露后六个月的分析

《ACS Omega》：Long-Term Effects of Radiation Therapy on Cerebral Microvessel Proteome: A Six Month Post-Exposure Analysis

放射治疗诱导脑微血管代谢紊乱及线粒体功能障碍是认知障碍的重要机制。通过比较12 Gy X射线辐照与假照组小鼠的脑微血管蛋白质组学差异，发现414个蛋白显著改变，其中157个上调、257个下调。生物信息学分析显示氧化磷酸化、三羧酸循环和糖酵解代谢通路受抑制，同时线粒体功能失调、血管通透性增加及炎症反应相关通路被激活。Western blot验证了线粒体复合体I和IV亚基蛋白（NDUFA11、NDUFB8、SDHB、MT-CO2）表达下调。本研究首次系统揭示长期辐射导致脑微血管能量代谢损伤及线粒体结构破坏，为开发靶向干预策略提供依据。

　　辐射治疗（RT）是一种用于治疗原发性和转移性脑肿瘤的重要手段，据统计，约有一百万美国患者在接受治疗后能够存活超过六个月。然而，高达90%的幸存者会经历由辐射引起的认知功能下降。近年来，有新的证据表明认知能力的下降与辐射导致的脑微血管内皮功能障碍密切相关。尽管如此，关于这一现象的体内研究仍较为有限。因此，探索连接辐射、内皮损伤和认知功能下降的分子及细胞通路对于开发针对性干预措施具有重要意义。

为了填补这一研究空白，我们对接受12 Gy辐射的五只小鼠和对照组的五只小鼠在辐射治疗后六个月的脑微血管进行了定量蛋白质组学分析。我们利用了基因本体（GO）富集分析、Mitocarta分析、Ingenuity Pathway Analysis（IPA）和iPathwayGuide等生物信息学工具，以识别受影响的通路。这些发现通过Western blot进行验证。结果显示，辐射显著改变了414种蛋白质的表达，其中157种上调，257种下调。GO分析表明代谢通路受到了干扰，而Mitocarta分析则揭示了在失调蛋白中存在大量线粒体相关蛋白。IPA分析识别出76种富集的通路，包括34种转录调节因子、6种核受体和5种生长因子，这些通路可能与辐射诱导的损伤反应有关。IPA预测了辐射组中线粒体功能障碍的存在，这一结论通过Western blot得到验证。研究结果表明，脑微血管中存在显著的蛋白质组学变化，提示辐射可能引发脑微血管的代谢功能障碍，包括氧化磷酸化、三羧酸循环（TCA cycle）和糖酵解等过程的异常。

### 引言

微血管损伤是辐射治疗后多种器官中晚期辐射损伤的标志性特征，具体表现因辐射范围而异。这种损伤被认为会促进辐射诱导的肾功能障碍、皮肤纤维化和心力衰竭等病理过程。在脑肿瘤治疗中，这种辐射对正常组织的影响尤为明显。事实上，多达90%的患者在接受辐射治疗后三个月至六个月会出现认知功能下降。微血管损伤、神经炎症和神经元损伤被认为是导致认知功能下降的潜在机制。微血管损伤可能破坏血脑屏障（BBB），从而引发炎症细胞浸润和炎症反应。此外，微血管损伤可能导致血管壁细胞的凋亡和衰老，进而引起血管稀疏、血流减少和缺血。尽管已有共识认为微血管损伤在这一过程中起重要作用，但其具体机制和对认知功能下降的影响程度仍不明确。此前的研究已经使用蛋白质组学方法对小鼠整个脑组织、海马区、血管内皮膜和小胶质细胞信号通路进行了分析。然而，到目前为止，还没有研究使用无标签定量蛋白质组学方法来探讨辐射对脑微血管的长期影响。因此，这种分析对于理解辐射诱导的微血管损伤及其在认知功能下降中的作用至关重要。

为了解决这一问题，我们旨在揭示辐射治疗后六个月脑微血管的蛋白质组变化。我们选择使用12个月大的雄性小鼠，因为它们在年龄上大致相当于60岁的人类，接近接受脑肿瘤放疗的患者中位年龄。值得注意的是，脑部辐射损伤存在年龄依赖性，年轻和老年个体的病理变化最为显著。我们选择六个月的随访期是为了聚焦于辐射损伤的慢性变化。之前的研究，包括我们自己的工作，已经提出了一些可能影响辐射长期效应的通路，如线粒体损伤、血管运输改变以及细胞粘附和紧密连接的变化。为了获得对辐射对脑微血管影响的无偏见视角，我们使用了Ingenuity Pathway Analysis（IPA）和iPathwayGuide等生物信息学工具，以识别显著受影响的通路。此外，我们还通过免疫印迹（Western blot）验证了蛋白质组学发现和生物信息学结果。

### 材料与方法

我们采用了12个月大的雄性C57BL/6J小鼠进行实验。这些小鼠被随机分配到治疗组（RT）或对照组，每组各有五只小鼠。小鼠被饲养在恒温环境中，遵循12小时光照/黑暗循环，并提供标准的啮齿类动物饲料和自由饮水。为了减少性别相关的干扰因素，我们仅使用雄性小鼠。对照组小鼠（n=5）接受模拟辐射处理，即在麻醉状态下被放置在辐射室中，但不进行实际照射。治疗组小鼠（n=5）则接受12 Gy的X射线照射，使用XStrahl小型动物辐射研究平台，该平台采用60 kVp的0.2 mm Al质量束进行锥形束CT扫描，并使用220 kVp的0.63 mm Cu质量束进行治疗。所有小鼠在辐射治疗后六个月被处死进行分析。未排除任何样本。所有实验程序均遵循《实验动物护理与使用指南》，并获得爱荷华大学和爱荷华城退伍军人事务医疗中心的机构动物护理与使用委员会的批准。本研究遵循ARRIVE指南2.0，以确保动物研究的透明度、严谨性和可重复性。

为了获取脑微血管蛋白，我们将小鼠处死后，用100%的二氧化碳吸入法进行安乐死，随后进行颈椎脱位。从对照组和辐射组中获取的脑组织被手术取出，用冰冷的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗，然后在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C。脑微血管的分离遵循Lee等人的方法。简而言之，脑组织在MCDB 131培养基中用松动型Dounce研磨器进行匀浆，随后在4°C下以2,000 g离心15分钟。沉淀物用15%（质量/体积）的70-kDa右旋糖酐溶液重新悬浮，并在4°C下以7,000 g离心15分钟。上层含有髓鞘和脑实质细胞的液体被丢弃。微血管通过40-μm细胞筛收集，用冰冷的DPBS洗涤，并转移至含有0.5%（质量/体积）BSA的MCDB 131培养基中。随后，样品在4°C下以16,100 g离心30分钟，收集沉淀物进行分析。

对于蛋白质提取，分离的微血管沉淀物与130 μL的RIPA缓冲液混合，其中包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。混合物在30秒内以800 rpm的速度涡旋三次，随后在15–20°C下振荡30分钟。样品再次涡旋后，在95°C下加热10分钟。为了进一步分解组织，使用Covaris E220聚焦超声破碎仪（参数包括：水位设定点为10，水温为6°C，峰值功率为175 W，占空比为10%，每周期200次，持续时间为300秒）进行破碎。破碎后的裂解液转移至Eppendorf管中，并在4°C下以16,100 g离心30分钟。收集上清液并储存在-80°C。总蛋白浓度使用BCA蛋白测定试剂盒（Pierce #23225）进行测定。最后，每份样品取30 μg的蛋白用于定量蛋白质组学分析。样品被标记为数值标识符，这些标识符不包含关于辐射或模拟辐射的信息，并被送往蛋白质组学分析。

蛋白质消化采用SP3方法。每份样品中，30 μg的蛋白在150 μL的裂解缓冲液中与10 μL的SP3珠（A和B珠的1:1混合）一起孵育。加入纯乙腈（ACN，VWR Chemicals）至最终浓度为70%（体积/体积）。样品在800 rpm下混合18分钟，随后放置在磁力架上3分钟以固定SP3珠。弃去上清液，SP3珠用1 mL的80%乙醇/水（体积/体积）洗涤三次，并用800 μL的ACN洗涤一次。结合的蛋白用10 mM的1,4-二硫苏糖醇（DTT，Sigma）在50 mM的碳酸氢铵（pH 8.0）中还原，并在37°C下以800 rpm的速度孵育1小时。蛋白随后用55 mM的2-氯乙酰胺（CAA，Sigma）进行烷基化，并在37°C下孵育1小时。最后，每份样品加入1 μg的胰蛋白酶（Thermo Scientific），并在37°C下以800 rpm的速度孵育过夜。消化产物用甲酸（FA，Carlo Erba）酸化至最终浓度为1%（体积/体积），真空干燥后储存在-80°C以备后续使用。

自动离线肽分离和液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）分析采用AssayMAP Bravo平台和5 mL的RP-S色谱柱进行。色谱柱首先用150 μL的异丙醇、乙腈（ACN）和缓冲液B（80% ACN在10 mM的甲酸钠溶液中）进行预处理，流速为50 μL/min。随后，色谱柱用100 μL的缓冲液A（25 mM的甲酸钠溶液，pH 10）进行平衡。肽被以5 μL/min的速度加载，收集流出液（FT）。使用逐渐增加的乙腈浓度（5%、10%、15%、20%、25%、30%、80%）进行洗脱。七份洗脱液被合并为四份最终洗脱液，并在-80°C下储存。

纳米流LC-MS/MS分析使用Dionex Ultimate 3000 UHPLC+系统与Orbitrap Eclipse质谱仪（Thermo Fisher Scientific）耦合进行。肽首先被送入捕集柱（75 μm内径×2 cm，内装5 μm Reprosil C18珠），并以5 μL/min的流速用0.1%的甲酸（FA）洗涤10分钟。随后，肽被转移到分析柱（75 μm内径×45 cm，内装3 μm Reprosil C18珠）中，并以300 nL/min的流速进行色谱分离。色谱分离使用溶剂B（0.1% FA，5%二甲基亚砜（DMSO）在ACN中）和溶剂A（0.1% FA，5% DMSO在水中）的线性梯度，总运行时间为90分钟。

全扫描MS光谱在Orbitrap中记录，范围为360至1300 m/z，分辨率为60,000，自动增益控制（AGC）目标为100%，最大注入时间（maxIT）为50 ms。最强烈的前体离子被隔离，并使用1.3 m/z的隔离窗口进行高能碰撞碎裂（HCD）。碎片离子在Orbitrap中记录，分辨率为15,000，AGC目标为200%，最大注入时间为22 ms。归一化碰撞能量（NCE）设置为25%。选择的前体离子电荷状态为2至6，且在2秒的周期内进行碎片化。动态排除设置为35秒。

### 蛋白质鉴定与定量分析

原始质谱数据使用MaxQuant（版本2.2.0.0）及其内置的Andromeda搜索引擎进行处理。光谱被搜索至UniProtKB数据库中的小鼠（UP000000589，55,338条目，2022年10月下载）。酶特异性设置为胰蛋白酶，允许最多两次错切。搜索包括半胱氨酸的碳酰胺化修饰作为固定修饰，以及蛋白N端乙酰化和蛋氨酸氧化作为可变修饰。鉴定结果被过滤以达到1%的假发现率（FDR）在蛋白和肽水平。启用了“匹配跨运行”和“第二肽”选项。使用MaxLFQ算法进行无标签定量（LFQ）。质谱蛋白质组学数据已通过ProteomeXchange联盟存入PRIDE数据库，数据集标识符为PXD058732（网站：http://www.ebi.ac.uk/pride，用户名：[e-mail]，密码：RJJaEf7seviy）。

蛋白质组学数据的分析和通路富集分析使用HemI 2.0网络工具进行。富集分析评估了蛋白质在生物过程、细胞位置、分子功能和KEGG通路中的影响。通过IPA和iPathwayGuide进行的通路分析揭示了显著受影响的通路，这些通路可能与脑微血管功能障碍有关。此外，我们还进行了免疫印迹（Western blot）以验证蛋白质组学发现和生物信息学结果。

### 结果

为了研究辐射对脑微血管的影响，我们对接受12 Gy辐射的雄性小鼠在治疗后六个月的脑微血管进行了定量蛋白质组学分析。研究的完整流程如图1A所示，而图1B展示了用于鉴定和定量脑微血管蛋白的高通量方法。总共检测到7,462种蛋白质，其中2,457种被定量（见表S1和表S2）。标签自由定量（LFQ）结果显示，对照组和辐射组的生物重复样本之间存在良好的可重复性，如图1C所示。使用主成分分析（PCA）对所有鉴定蛋白质的LFQ强度进行分析，结果显示对照组和辐射组之间存在显著差异，表明辐射显著改变了蛋白质表达（见图1D）。

在蛋白质组学分析中，我们发现257种蛋白质在辐射组中显著下调，157种上调。这些变化可能与线粒体功能障碍和代谢通路的破坏有关。我们还利用Helm网络工具对这些变化进行了进一步分析。结果表明，受影响的蛋白质主要集中在细胞膜、线粒体内膜和核斑（一种与剪接因子相关的亚核结构）。关键受影响的生物过程包括mRNA剪接和加工、线粒体呼吸链复合物I的组装以及三羧酸循环（TCA cycle）。分子功能方面，受影响的蛋白质主要与蛋白质和RNA结合活动相关。完整的分类和校正p值列表见表S5。

此外，我们还使用iPathwayGuide对所有变化进行了分析，该工具不同于其他功能分析工具，因为它考虑了基因在每条通路中的位置及其与其他基因的相互作用。分析结果显示，显著失调的蛋白质富集于266条通路，其中最强的通路包括代谢通路、核细胞质运输、一碳代谢、氧化磷酸化、剪接体和三羧酸循环（见图3A-F）。这些通路的变化可能与辐射引起的长期损伤有关。值得注意的是，一些非代谢通路也显著富集，包括cGMP-PKG信号通路、血管平滑肌收缩、mRNA监控、钙信号通路等。此外，剪接体和mRNA监控通路中的蛋白质在辐射组中上调，这可能表明辐射导致了转录和转录后修饰的增加。完整的富集通路和校正p值列表见表S6。

为了进一步验证这些变化对线粒体功能的影响，我们使用IPA核心分析模块对线粒体蛋白数据集进行了分析。该分析识别出14条富集的通路，其中10条被预测为抑制，4条被激活。主要抑制的通路包括氧化磷酸化、中性粒细胞胞外陷阱信号通路和三羧酸循环。此外，上游调节因子分析揭示了14条富集的调节因子，其中CLPB和HIF1A是激活的调节因子，而TEAD1、PPARGC1A和RB1是抑制的调节因子（见图5E）。表S10提供了完整的通路、上游调节因子和相关p值列表。最后，我们使用IPA软件对失调的线粒体蛋白进行了疾病和生物学功能的映射分析，结果表明22条疾病和生物学功能被富集，其中17条被预测为抑制，5条被预测为激活。值得注意的是，ATP合成和核酸代谢被预测为减少，而活性氧（ROS）的合成、产生和代谢被预测为增加（见图5F）。

### 代谢通路在辐射后脑微血管中的变化

能量代谢对于生物合成过程至关重要，有助于细胞损伤的修复。尽管已有大量研究探讨了辐射对心脏能量代谢的影响，以及在其他组织中的代谢通路变化，但关于辐射对脑微血管代谢的影响仍知之甚少。我们的蛋白质组学分析显示，与关键代谢通路相关的蛋白质表达发生了变化，包括氧化磷酸化（n=29）、三羧酸循环（n=15）和糖酵解（n=7）（见图S4 A-C）。IPA分析表明这些代谢通路被抑制。为了验证这些发现，我们使用免疫印迹（Western blot）分析了氧化磷酸化、三羧酸循环和糖酵解中失调的蛋白质。

我们的分析显示，辐射引起了氧化磷酸化系统中多种蛋白的表达变化。Western blot图像（见图S5 A-E）显示，辐射组中复合物I的蛋白NDUFA11和NDUFB8、复合物II的蛋白SDHB以及复合物IV的蛋白MT-CO2显著下调（见图6A-C）。尽管复合物III和V的蛋白ATP5F1C、ATP6VID和ATP5F1A的表达也有所下降，但这些变化未达到统计学显著性（见图6A-C和图S6 A–D）。此外，我们还分析了与三羧酸循环、糖酵解和丙酮酸转运相关的蛋白，发现这些蛋白在辐射组中表现出非显著的趋势性下降（见图S7 A-B）。同样，糖酵解和丙酮酸转运蛋白的分析显示，辐射组中糖酵解蛋白TPI和ENOL2以及线粒体丙酮酸载体蛋白MPC1和MPC2也表现出类似的趋势（见图S7 C–D和图S8 A-B）。

### 讨论

本研究首次深入分析了C57BL/6J小鼠在接受辐射治疗后六个月脑微血管的蛋白质组变化，提供了关于辐射对血管健康影响的关键见解。我们共鉴定出414种失调蛋白，其中257种显著下调。这些结果突显了线粒体功能障碍和代谢通路的破坏是主要特征，对氧化磷酸化、三羧酸循环和糖酵解等通路产生了显著影响。

通路富集分析显示，266条通路发生了显著变化。在76条富集的通路中，68条被抑制（例如氧化磷酸化），而8条被激活（例如线粒体功能障碍）。线粒体相关蛋白受到了特别影响，详细分析显示有84种线粒体蛋白在辐射组中下调，这些蛋白与线粒体内膜和呼吸链复合物I相关，表明能量代谢受到了破坏。

蛋白质组学变化还揭示了ATP合成、细胞迁移等生物过程的抑制，这些过程通过核细胞质运输和剪接体活动等通路受到影响。增加的氧化应激被证据表明是由线粒体功能障碍引起的，可能通过线粒体DNA损伤和电子传递链（ETC）功能障碍机制。此外，线粒体DNA片段作为损伤相关分子模式（DAMPs）可能通过炎症信号通路引发反应。这些发现强调了辐射对脑微血管的长期影响，特别是在线粒体健康和代谢通路上。

线粒体信号在辐射诱导的组织损伤中也扮演了重要角色。尽管线粒体活性氧（ROS）被广泛认为是线粒体DNA损伤和ETC功能障碍的介质，但其他因素，如线粒体钙离子的流入和流出变化，也可能对辐射引起的损伤产生影响。此外，线粒体DNA片段可能通过炎症信号通路驱动辐射后的反应。

除了线粒体和代谢蛋白组的变化，我们的研究还揭示了与mRNA剪接和应激反应通路相关的蛋白失调，表明辐射可能促使转录和转录后修饰的改变。这些变化可能破坏细胞稳态和蛋白质合成，进一步加剧血管功能障碍，因此需要进一步研究。

本研究有几个局限性。首先，我们仅使用雄性小鼠，这是为了减少雌性周期带来的变异性。然而，鉴于已有证据表明男性和女性在辐射敏感性上存在差异，未来的研究应包括雌性小鼠，以更全面地理解性别在微血管损伤和认知结果中的影响。其次，目前的批量蛋白质组学方法无法区分不同血管相关细胞类型（如周细胞、星形胶质细胞和内皮细胞）的贡献。因此，需要采用更先进的技术，如单细胞蛋白质组学、空间转录组学或荧光激活细胞分选（FACS）来获得更高分辨率的、细胞类型特异性的信息。第三，我们的观察仅限于一个辐射后的时间点和较小的样本量。未来的研究需要采用多个时间点和更大的样本量，以捕捉微血管损伤的时间动态变化，并提高对辐射后蛋白表达细微变化的检测灵敏度。最后，需要进一步的验证和机制研究，特别是与线粒体功能、血脑屏障完整性以及RNA加工通路相关的蛋白质组学数据和生物信息学预测。

总之，本研究提供了辐射诱导的脑微血管蛋白质组变化的首次证据，包括线粒体功能障碍、代谢通路的破坏以及血管信号通路的失调。据我们所知，这是首次采用定量蛋白质组学方法研究脑微血管在辐射治疗后的变化。这些发现为理解辐射诱导的血脑屏障破坏提供了新的视角，并强调了在辐射暴露背景下，线粒体在内皮细胞和其他血管相关细胞类型中的作用。此外，这些结果也突显了进一步研究线粒体完整性、细胞代谢和血管健康之间相互作用的重要性。