利用乳酸植物杆菌（Lactiplantibacillus）菌株从甘蔗渣水解物中生产乳酸

《ACS Omega》：Lactic Acid Production from Sugarcane Bagasse Hydrolysates by Lactiplantibacillus Strains

本研究利用蒸汽爆破预处理甘蔗渣（SCB），筛选出高效利用五碳糖的Lactiplantibacillus pentosus ATCC 8041菌株。该菌株在含半纤维素水解液（HEM）和总水解液（TH）的培养基中分别实现乳酸（LA）浓度2.4 g/L和28.99 g/L，产率0.65 g/g和0.78 g/g，证实其能有效协同利用SCB中的六碳糖和五碳糖，为可持续生物降解塑料PLA生产提供新途径。

　　在当今全球对可持续材料日益增长的需求背景下，乳酸（LA）作为一种重要的有机酸，被广泛应用于食品、化妆品、制药、纺织和化工等多个行业。同时，乳酸是合成聚乳酸（PLA）的关键原料，而PLA作为一种可生物降解和可生物吸收的材料，正在逐步替代传统的石油基塑料。随着环保意识的提升和生物材料技术的发展，乳酸的生产需求持续上升，预计到2025年将达到1960.1万吨，市场价值约为98亿美元。因此，研究如何高效、经济地生产乳酸成为生物材料领域的重要课题。

传统的乳酸生产主要依赖于化学合成，这种方法虽然效率较高，但通常会产生不纯的DL型乳酸，而微生物发酵则能够生产出具有光学纯度的L（+）或D（?）型乳酸，这些产品在市场上更具价值。然而，微生物发酵过程中，仍然主要使用葡萄糖作为碳源，而葡萄糖的获取成本较高。在此背景下，农业废弃物作为一种可持续、广泛可得且成本低廉的资源，成为乳酸生产的理想替代原料。特别是，这些废弃物中富含由纤维素衍生的葡萄糖以及由半纤维素衍生的戊糖，为发酵提供了丰富的可利用糖分。然而，大多数微生物无法高效代谢戊糖，这限制了半纤维素资源的利用价值。此外，戊糖的代谢通常受到葡萄糖的抑制，导致微生物只能在葡萄糖耗尽后才开始利用戊糖，这在一定程度上影响了乳酸的产量和生产效率。

为了克服上述挑战，筛选能够同时代谢戊糖和己糖的微生物变得至关重要。许多微生物已被研究作为乳酸的潜在生产者，包括乳酸菌（LAB）、曲霉菌（Aspergillus）、芽孢杆菌（Bacillus）、大肠杆菌（Escherichia）和酿酒酵母（Saccharomyces）等。其中，乳酸菌因其对酸性环境的耐受性、较高的乳酸产量和生产效率以及安全性等优势，成为生物乳酸生产的主要选择。乳酸菌可以分为同型发酵菌和异型发酵菌，前者主要通过葡萄糖产生乳酸，而后者则能够产生乳酸、乙酸和乙醇等产物。

巴西和印度是全球最大的甘蔗生产国，甘蔗的加工过程会产生大量甘蔗渣（SCB）作为副产品。据估计，全球每年产生的甘蔗渣超过4800万吨，其中约70%被用作锅炉燃料和能源生产，这有助于糖业的能源自给自足。然而，剩余的甘蔗渣通常被存放在露天的堆放场，这不仅造成环境问题，如灰尘排放、地下水污染和自燃风险，还可能对周边社区产生负面影响。为了解决这些问题，利用甘蔗渣生产乳酸成为一种有前景的策略，因为其富含纤维素（32–45%）和半纤维素（20–32%）。

纤维素、半纤维素和木质素分子之间的强共价键和氢键使得直接利用这些材料中的糖分变得困难。因此，需要对这些材料进行预处理以释放可发酵的糖分。蒸汽爆破（SE）作为一种低能耗和环保的预处理方法，能够有效溶解半纤维素中的糖分、破坏木质纤维素纤维并改变纤维素的结构。通过增加纤维素和半纤维素的可接近性，蒸汽爆破提高了酶解效率，从而提高了糖分的产量。与其它技术相比，蒸汽爆破具有更好的可扩展性、更低的能耗、避免了循环利用的需要，并且减少了如糠醛、5-羟甲基糠醛（HMF）和乙酸等抑制性物质的形成，这些物质可能会影响乳酸的生产。

甘蔗渣水解液是一种重要的可发酵糖分来源，它作为低成本的原料具有较高的生物技术应用潜力。然而，发酵途径仍然面临技术与经济上的挑战，包括预处理和糖解过程中产生的抑制性化合物、微生物对己糖和戊糖的共发酵能力、碳分解抑制现象、乳酸的光学纯度控制以及底物和产物积累带来的抑制作用。因此，开发更高效的生物质预处理策略、选择和适应能够在真实水解液中利用二代（2G）糖分的微生物菌株，以及研究合适的发酵过程条件，对于克服这些障碍至关重要，从而提高乳酸从木质纤维素生物质生产的技术和经济可行性。

本研究旨在通过蒸汽爆破预处理获得可发酵的糖分，并评估在选择最高效的戊糖利用微生物菌株后，利用半纤维素水解液（HEM）和总水解液（TH）进行乳酸生产。通过这种方式，本研究不仅满足日益增长的乳酸需求，还为发展经济可行且环境可持续的生物工艺做出贡献，符合循环经济的原则，推动农业废弃物的资源化利用以及木质纤维素生物质基生物精炼厂的发展。

在本研究中，使用了九株乳酸菌菌株，这些菌株来源于多个菌种库，包括NRRL ARS Collection（美国伊利诺伊州皮奥里亚）、Fiocruz基金会（巴西里约热内卢）以及André Tosello基金会（巴西坎皮纳斯）。菌株的筛选通过酸化试验进行，试验使用9厘米的培养皿，培养基为含有20克/升戊糖的MRS水解液（MRS_xyl）和含有20克/升葡萄糖的MRS培养基（MRS_glu）。试验过程中，观察到菌株的生长情况和酸化程度，通过培养皿的颜色变化来判断酸化能力。

在初步筛选后，对于能够有效代谢戊糖的菌株，进行了液态培养试验，以获得更精确的数据支持菌株的选择。试验使用了100毫升的锥形瓶，每个锥形瓶中加入30毫升的培养基，并在150转/分钟的机械搅拌下进行培养。菌株的生长情况和代谢能力被评估，其中一些菌株如L. delbrueckii subsp. lactis NRRL B-445和L. delbrueckii NRRL B-445在液态培养中表现出较差的生长能力。因此，采用了Ohara等人和Thomas提出的替代培养基以改善这些菌株的生长表现。

最终，L. pentosus ATCC 8041在液态培养中表现出最优异的戊糖代谢能力和乳酸生产能力。在使用MRS_xyl培养基的锥形瓶中，该菌株在30小时内实现了92%的戊糖消耗，总酸度（TA）达到17.88克/升，乳酸产量达到11.68克/升，这表明其具有较高的乳酸生产效率。在2升的Biostat A Plus发酵罐中，该菌株表现出更高的乳酸产量，达到28.99克/升，乳酸产量达到0.78克/克，表明其在实际生产条件下的优异性能。

这些结果表明，L. pentosus ATCC 8041不仅能够有效代谢戊糖，还能在含有己糖的条件下进行共发酵，显示出其对复杂底物的适应能力。此外，该菌株在发酵过程中表现出较高的耐受性，能够有效处理水解液中的抑制性化合物，如乙酸、糠醛和HMF，这使得其在不进行预处理的情况下也能实现高效的乳酸生产。这一发现不仅对乳酸的工业生产具有重要意义，也为可持续生物工艺的发展提供了新的思路。

在实验室和工业应用中，乳酸菌的代谢能力受到多种因素的影响，包括培养基的组成、发酵条件以及微生物的生理特性。为了进一步优化发酵过程，本研究还评估了不同培养基对乳酸菌生长和乳酸生产的影响。通过比较不同培养基的乳酸产量、产物浓度和菌株生长情况，发现L. pentosus ATCC 8041在含有戊糖的培养基中表现出最佳的性能，这与其对戊糖的高效利用能力有关。

此外，乳酸菌的代谢途径也对乳酸的生产效率产生重要影响。在含有戊糖的培养基中，L. pentosus ATCC 8041表现出对戊糖的快速代谢能力，这与其使用磷酸酮醇酶途径有关。在该途径中，戊糖被分解为甘油醛-3-磷酸，进一步转化为乳酸，而乙酰磷酸则被代谢为乙酸。这一代谢机制使得L. pentosus ATCC 8041能够在复杂的水解液中高效生产乳酸，而不受抑制性物质的显著影响。

本研究还探讨了不同发酵条件对乳酸产量和生产效率的影响。通过在不同温度和pH条件下进行发酵试验，发现L. pentosus ATCC 8041在30°C和pH 6.0的条件下表现出最佳的生长和代谢能力。这表明，控制发酵条件对于提高乳酸产量和生产效率具有重要意义。同时，研究还发现，L. pentosus ATCC 8041在含有戊糖和己糖的混合水解液中表现出良好的共发酵能力，这可能与其对己糖的优先利用有关。

总的来说，L. pentosus ATCC 8041在利用甘蔗渣水解液生产乳酸方面表现出显著的优势。这不仅是因为其能够有效代谢戊糖和己糖，还因为其在发酵过程中表现出较高的耐受性和生产效率。通过本研究，可以为乳酸的工业生产提供新的思路和方法，同时也为农业废弃物的资源化利用和生物精炼厂的发展做出贡献。未来的研究可以进一步探索如何优化发酵条件，提高乳酸产量和生产效率，以及如何减少发酵过程中的抑制性物质的影响，从而实现更高效、可持续的乳酸生产。