通过两种不同的血红蛋白从NH2OH生成氧化性HNO的机制，以及血红蛋白、邻近残基和蛋白质环境对这些过程的影响

《ACS Omega》：Oxidative HNO Formation Mechanisms from NH2OH via Two Different Heme Proteins and Effects from Hemes, Nearby Residues, and Protein Environments

本研究通过密度泛函理论和量子力学-分子力学方法，比较了中性组氨酸轴配体肌红蛋白（Mb）与负性酪氨酸轴配体过氧化氢酶（CAT）催化羟胺（NH2OH）生成硝氧基（HNO）的机制差异，揭示了轴配体和蛋白环境对反应能垒的影响，并验证了实验观测的活性趋势差异。

　　硝roxyl（HNO）是一种具有生物活性的氮氧化物，它在多种疾病治疗中展现出潜在价值。然而，其内源性生成机制仍不完全清楚。此前的实验研究表明，羟胺（NH?OH）可能是生理前体，它在过氧化氢（H?O?）激活的血红素蛋白作用下被氧化生成HNO。本研究通过密度泛函理论（DFT）和混合量子力学与分子力学（QM/MM）计算，探讨了从NH?OH生成HNO的反应机制，研究了两种代表性的血红素蛋白——肌红蛋白（Mb）和过氧化氢酶（CAT），它们分别具有中性与负电荷的轴向配体。为了更详细地了解蛋白环境对反应的影响，我们研究了包含蛋白质更多成分的多种结构模型。

研究结果揭示了一条由铁的氧化态I（Cpd I）物种启动的分步双氢原子提取路径，其中第一步的氢原子提取是速率决定步骤。具有中性组氨酸轴向配体的Mb表现出比具有负电荷酪氨酸配体的CAT更低的反应能垒，这与实验观察的反应活性趋势一致。蛋白环境的影响，包括远端氢键和空间位阻，被发现调节了质子亲和力和电子转移，从而影响反应能垒。QM/MM计算确认，虽然靠近血红素中心的关键残基可以通过氢键促进HNO的形成，但整个蛋白环境中的空间限制会提高反应能垒。这些机制的见解解释了实验中观察到的HNO产率差异，并强调了蛋白质结构和血红素配位对硝roxyl生物合成的影响。

在研究HNO的形成机制时，我们采用了不同级别的结构模型，包括从简单的模型到包含更多蛋白成分的复杂模型。这些模型帮助我们理解了轴向配体和蛋白环境如何影响反应的活性和能垒。与之前仅报告Mb催化NH?OH生成HNO的基本机制不同，本研究系统地解析了从血红素核心到远端残基和整个蛋白结构对反应趋势的贡献，从而提供了超越先前研究的新见解。此外，我们还提供了HNO生成路径中所有物种的能量、几何结构和其他电子特性的详细资料，为更全面地理解控制HNO合成的结构和电子因素提供了依据。

在计算细节方面，我们使用了两种理论方法：量子力学（QM）和混合量子力学与分子力学（QM/MM）。所有计算均使用Gaussian 09程序进行。对于Mb的反应，我们使用了三种结构模型：简单模型（s）、Cα模型和复杂模型（cp），分别表示为Mb-s、Mb-Cα和Mb-cp。对于CAT的反应，仅使用了简单模型和复杂模型。初始结构基于PDB文件1DWR（马心肌红蛋白）和2IQF（Helicobacter pylori过氧化氢酶）的X射线晶体结构。在所有QM模型中，血红素组被简化为非取代的卟啉。在简单模型中，轴向配体His和Tyr被简化为咪唑和酚盐。在Mb的Cα模型中，最接近的远端残基His64被包含。复杂模型则包括距离Fe在6 ?以内的远端残基，这些残基包括His93、Leu29、Phe43、His64、Val68和Ile107。对于CAT，尽管Ser95不在6 ?范围内，它也被包含在复杂模型中，因为其参与了一个与His56、Asn129和W1321之间的氢键网络。

简单模型的计算没有施加任何限制，而Cα和复杂模型的计算则进行了部分几何优化，其中蛋白残基在Cα位置被截断，边界Cα原子被固定在X射线晶体结构位置，以模拟蛋白环境的限制。在质量加权的Hessian中，原子约束通过Gaussian推荐的标准方法处理，即在原子坐标部分中将复杂模型的终端Cα原子赋予?1的值。这种处理方式避免了由于固定原子导致的Hessian计算生成虚频的问题。在每种情况下，优化和频率计算均采用PCM方法，使用4.0的介电常数来模拟蛋白环境，如之前对类似血红素和蛋白质的处理所示。频率分析用于所有模型，以验证不同势能表面上的静止点性质，并提供零点能修正的电子能量、焓和吉布斯自由能。

我们使用了相同的DFT方法，这些方法在之前对血红素蛋白、铁卟啉和其他金属蛋白与金属配合物的HNO反应中提供了准确的预测。几何优化和随后的频率计算使用了mPW1PW91方法，其中Fe使用了LanL2DZ基组，NH?OH及其第一配位壳层原子使用了6–311++G(2d,2p)基组，其余部分使用了6–31G(d)基组。mPW1PW91泛函是一种混合的广义梯度近似（GGA）泛函，它结合了HF交换与Perdew–Wang 1991交换泛函，后者由Adamo和Barone修改。这种计算方法的选择基于之前的方法学研究，这些研究比较了多种流行的DFT方法。例如，与近期开发的M06和分散校正的ωB97XD方法相比，mPW1PW91在描述某些步骤时没有问题；与最新开发的混合DFT方法MN15相比，也没有显著差异，因为它们都能准确预测实验X射线结构和反应活性趋势。总的来说，我们的计算方法在效率和准确性方面都优于更先进的耗时方法，因此被用于本研究的计算。然而，我们也认识到，未来使用更精心选择的分散校正泛函可能会提供更多的定量改进，尽管在本研究中我们主要关注反应趋势的定性分析，因为没有定量的实验能垒可供比较或进一步开发特定方法。

在QM/MM计算中，我们使用了ONIOM方法，该方法在研究金属蛋白，包括血红素蛋白方面已被成功应用。计算的初始结构基于之前纯量子化学计算中使用的相同PDB文件（1DWR和2IQF）。我们检查了Mb的整个X射线结构，并纠正了两个错误：一个乙烯基被误认为甲基，以及His93中缺失的氢原子。此外，实验中引入的两个SO?2?溶剂分子也被移除。CAT的QM/MM模型基于链A的2IQF结构，添加了缺失的Tyr339氢原子。模型包括所有距离铁原子在15 ?以内的氨基酸残基。截断残基的N-和C-末端分别用乙酰基（CH?COO）和甲基氨基（ONHCH?）进行封端。在优化过程中，封端组的重原子被固定在晶体结构位置。对于Mb和CAT的蛋白模型，卟啉（不含侧链）、Cpd I中的氧原子、轴向配体His/Tyr以及NH?OH均使用了与上述相同的DFT方法，进行几何优化和频率分析。其余部分的蛋白则使用Gaussian 09中的分子力学（MM）方法AMBER。所有蛋白残基的AMBER类型力场参数，包括电荷，均被使用。之前开发的血红素组的AMBER力场参数也被用于本研究，去除了一些不必要的参数并进行了必要的修正，以适应当前的底物变化。此外，一些缺失的MM电荷（见Tables S1和S2）是按照Merz–Singh–Kollman方案计算的。为了保持QM区域的总MM电荷为整数，对边界原子进行了轻微的电荷调整，如之前研究所示。之前报告的铁在血红素蛋白中的范德华参数也被用于本研究。所使用的ONIOM方法与我们之前成功研究Mb和CAT的HNO反应密切相关。

在研究H?O?处理后的Mb与NH?OH的反应路径时，我们还使用了简单模型，该模型的初始结构为Cpd I与NH?OH形成的中间复合物。实验上，NH?OH被大量过量以促进这种中间体的形成。使用这种中间体作为研究机制的起点也是近期两项关于氧化生成HNO的机制研究中采用的方法。在协同路径中，为了在一步中提取两个H原子，需要在初始加合物Mb-s–I–C中形成两个H键。我们研究了具有这种双H键模式的不同初始构型（见Figure S1）。然而，经过优化后，它只能形成一个H键，即O1···H2或O1···H5，如最近的计算报告所示。过渡态Mb-s–TS–C也尝试了类似的构型和电子配置，但没有形成协同的过渡态。类似地，Mb-s–P–C中仅有一个H键，即H2···O3或N4···H5。这些结果表明协同机制可能不利，这与之前报道的分步机制一致。为了帮助理解其来源，我们研究了NH?OH的构型，其中NH–OH原子在同一平面。如在支持信息（SI）第3部分所述，这些构型无法优化，强制NH–OH在同一平面的单点能量计算导致能量比最稳定构型高出约6–28 kcal/mol（见Table S3）。因此，协同路径不可行，因为构型不稳定性较高。

在分步机制中，第一步H原子的提取后，形成了铁-羟基复合物P-1（见Scheme 1）。在Cpd I中，Por?•和Fe?+都可以作为电子受体。哪一个会被首先还原？如果Por?•被首先还原，那么Fe?+–Por–OH（Cpd II）会在过程中形成；否则，形成Fe3+–Por?•–OH。M?ssbauer数据、共振拉曼和电子自旋共振（EPR）研究提供了Cpd II形成的直接实验证据。自由基中间体（NH?O）•在NH?OH和铁卟啉反应中被EPR检测到。Cpd II和（NH?O）•的存在也支持了分步机制。在第一步H原子的提取中，下一个问题是哪一个H原子会首先离开NH?OH？通过比较吉布斯自由能（见Table S4），自由基NH?O•的能量比•NHOH低12.40 kcal/mol，如最近的报告所示。因此，H2在第一步中被提取（从I-1到P-1，见Scheme 1）。然后，这个自由基部分会旋转，为第二步的HAT过程做准备（从I-2到P-2）。

由于Cpd I中S(Fe?+)=1和S(Por?•)=1/2的可能反磁性和顺磁性耦合，每个分子在路径中均被研究为双重态和四重态，除了P-2和P，因为HNO从P-2中释放，所以它是铁-水结合的还原态Mb。实验上已知P具有S=5/2，因此在本研究中被用于P-2和P。对于第一步的HAT，所有能量、几何结构、电荷和自旋密度在简单模型计算中均被比较（见Figure S4和Tables S4–S8），如最近的类似研究中发现的那样。因此，后续讨论中使用了S=1/2的结果。在第二步HAT中，最终生成HNO和六重态的还原态Mb，六重态也被在Mb-s-I-2中被优先选择，因此在机制讨论中使用了该状态。这些有利的自旋态随后被用于后续的Cα和复杂模型研究。所有研究物种的相对吉布斯自由能图（见Figure 1）展示了这些有利自旋态的结果。

在Mb-s-I-1中，Cpd I和NH?OH形成一个H键O1···H2，长度为1.826 ?（见Table 1）。H2被提取后，Fe = O键变为更弱的Fe–OH键，如Mb-s-I-1中的Fe–O1键长度从1.613 ?增加到Mb-s-P-1中的1.710 ?。第一步HAT后，Por?•被还原，这反映在自旋密度结果中：ραβ^NH?O从0.013变为?1.005e，ραβ^Por从?1.110变为?0.177 e。这种变化需要克服一个7.40 kcal/mol的能垒（ΔG?，见Table 1）。H2被转移后，ΔG在Mb-s-P-1中降低到?14.51 kcal/mol。在第二步HAT之前，O1–H2键在Fe–OH中旋转，NH?O•改变取向以形成H键O1···H5（见Figure 1）。从Mb-s-P-1到Mb-s-I-2，Fe–O1键增加了0.196 ?，这是由于新的H键O1···H5的拉伸力。当第二个H原子H5被转移时，Fe?+–OH被转化为Fe3+-(H?O)，Fe–O1键增大了约0.3 ?。第二步的H原子提取是无能垒的，因为所有尝试优化过渡态Mb-s-TS-2的结果均显示为Mb-s-I-2或Mb-s-P-2。由于自由基NH?O•的高反应性和短寿命，第二个H原子可能被迅速提取而无需能量成本。在细胞色素P450的C–H羟化反应中，自由基中间体的反弹步骤也被发现是无能垒的。从Mb-s-I-2到Mb-s-P-2，吉布斯自由能降低了12.42 kcal/mol。从Mb-s-P-2到Mb-s-P，能量又因释放HNO而降低5.21 kcal/mol。总体来看，NH?OH与H?O?处理的Mb反应的速率决定步骤是第一步的H原子提取。通过H?O?处理的Mb将NH?OH转化为HNO的过程在热力学上非常有利，反应能为?45.39 kcal/mol（见Table 1）。这些结果不仅重现了最近的计算研究中的分步两步HAT，而且更重要的是提供了路径中所有物种的几何和电子特性变化的详细数据，包括过渡态，这些数据在简单模型中未被报告过。

为了进一步探讨蛋白环境的影响，我们使用ONIOM方法研究了RDS，即第一步的H原子提取。计算的反应能垒ΔG?为9.72 kcal/mol（见Table S11），比复杂模型中的能垒高1.33 kcal/mol。NH?OH与附近残基Leu29、Phe43、Val68和Ile107的距离在约2.5 ?内，比复杂模型中的距离更短。因此，NH?OH被这些残基更紧密地包围，这些更强的分子间空间相互作用限制了底物的空间和自由度，从而降低了其反应活性。总体来看，NH?OH与H?O?处理的Mb的反应遵循分步的两步H原子提取路径，其中第一步是速率决定步骤。

在CAT中，HNO的生成机制与Mb类似，但具有不同的轴向配体。CAT的活性中心Fe与负电荷的轴向配体Tyr配位，这与Mb的中性组氨酸配位不同。然而，其实验上发现的HNO生成机制尚未报道。首先，我们使用简单模型研究了轴向配体对反应路径的主要影响。在简单模型中，Tyr被简化为酚盐（见Figure 2）。关于其构型，它可以倾斜或非倾斜。在原始X射线结构中是倾斜的，优化后，从CAT-s-I-2及其后续物种保持这一构型（见Figure 2）。然而，在CAT-s-I-1和CAT-s-TS-1中，它变得非倾斜。在CAT-s-I-1中，O1的电荷为?0.367e，比Mb-s-I-1中的O1电荷（见Table 1）更负0.051e。这使得O1更容易接受一个质子。血红素组的电荷在CAT-s-I-1中为0.220e，比Mb-s-I-1中的血红素组电荷更负0.802e。这使得它更难以接受电子。换句话说，Tyr增强了CAT的质子亲和力但降低了其氧化能力。这两种效应均来源于负电荷的轴向配体Tyr。然而，由于不利的血红素组电荷减少远大于有利的O1电荷减少，这导致了CAT-s-TS-1的ΔG?为10.47 kcal/mol，比Mb-s-TS-1的ΔG?为7.40 kcal/mol更高。此外，与Mb-s-I-1中的卟啉中心自由基不同，CAT-s-I-1中的ραβ^Por为?0.116 e，而Tyr的自旋密度ραβ^L为?1.030 e（见Table S14）。这表明未配对电子主要位于轴向配体Tyr上，而不是Por。开放壳层的Por在Mb-s-I-1中有助于Mb的血红素部分从NH?OH获得电子。因此，CAT中的负电荷轴向配体Tyr相较于Mb中的中性组氨酸配体，提高了反应能垒，这不仅与实验观察的反应活性趋势一致，还提供了对这种反应性差异的有趣电子见解。CAT路径中的提高能垒也与之前观察到的Tyr配位系统在另一HNO相关反应中的较低反应活性一致。

在CAT中，Fe–O1与附近的W1321水分子形成H键。W1321参与了与His56、Ser95和Asn129的H键网络。因此，我们将其包含在下一个模型研究中，类似于Mb的Cα模型，该模型也包含H键的部分。结果表明（见SI第8部分），这个H键使O1的电荷比简单模型中的O1电荷多负0.055 e，从而增强了O1的质子亲和力，并将第一步的HAT能垒降低了1.66 kcal/mol，类似于Mb的Cα模型的效果。

接下来，我们研究了第二配位壳层残基对CAT的影响。由于O3–N4（见Scheme 1）键的方向，CAT-cp-I-1有两种可能的构型。它可以朝向或远离W1321。在Figure 2中朝向W1321的构型比另一个构型的ΔG低1.72 kcal/mol（见Table S19），因此被用于后续讨论。在复杂模型中，除了之前讨论的W1321的有利氢键作用外，正电荷的残基Arg335与轴向配体Tyr339形成一个H键。这在一定程度上抵消了Tyr339负电荷对能垒增加的影响。因此，ΔG?在复杂模型中比简单模型降低了1.15 kcal/mol。这与Mb的复杂模型中的能垒增加不同。然而，CAT的复杂模型下的RDS能垒仍然比Mb高0.95 kcal/mol，因此其反应趋势仍与实验数据一致。

与Mb类似，CAT的第一步（RDS）反应也使用了QM/MM方法。值得注意的是，CAT的蛋白模型引入了简单模型中未观察到的新空间限制，显著提高了能垒到11.52 kcal/mol（见Table S24）。这一现象类似于Mb的计算，说明完整的蛋白结构如何改变反应活性。与CAT的复杂模型不同，NH?OH在ONIOM模型中被Val55和Phe142推向W1321附近，导致W1321与Fe–O1之间的H键断裂。相反，W1321中的氢原子与底物NH?OH形成一个1.925 ?的H键。由于原始H键对反应活性的增强作用，由于蛋白中附近残基的空间相互作用导致这一H键的断裂，使得能垒增加。CAT的较低反应活性与Mb相比，仍然符合实验数据。总体来看，CAT的RDS能垒在所有研究的简单、复杂和QM/MM模型中均高于Mb，其差值分别为3.09、0.95和1.80 kcal/mol。这些数据表明，轴向配体可能是调节HNO生成的关键因素，因为简单模型中来自轴向配体差异的3.09 kcal/mol的能垒差仅部分被蛋白中的其他相互作用所补偿。实际上，实验工作表明，所有具有His配体的血红素蛋白的反应活性均高于具有负电荷轴向配体的蛋白。我们的计算结果与实验报告的反应活性趋势一致。更重要的是，我们的结果提供了首次关于这种反应性差异的理论见解，揭示了负电荷配体对HAT步骤中电子转移过程的显著阻碍作用。远端残基和整体蛋白环境的有利和不利影响也被揭示，如复杂模型和蛋白模型所示，以提供对Mb和CAT不同反应性的全面理解。