用于检测SARS-CoV-2变异株的非竞争性荧光偏振适配体测定法

《ACS Omega》：Noncompetitive Fluorescence Polarization Aptamer Assay for Detecting SARS-CoV-2 Variants

非竞争荧光极化aptamer检测技术（NC-FPAA）用于快速、低成本检测SARS-CoV-2八种变种及评估特异性，发现M40 aptamer对病毒无交叉反应且检测灵敏度高。

　　随着全球范围内SARS-CoV-2疫苗的广泛接种，疫情已逐渐缓解。然而，新的病毒变种不断出现，给公共卫生带来了持续的挑战。尽管现有的诊断技术能够有效地检测特定的变种，但面对病毒的快速变异，亟需开发出一种具有广泛适用性的检测方法，这种方法应能够减少变异对检测结果的影响。特别是在大规模筛查和长期监测方面，快速、简便且成本低廉的检测技术尤为重要。本研究评估了一种非竞争性荧光偏振适配体检测方法（NC-FPAA）在SARS-CoV-2检测中的应用潜力，包括野生型病毒株和多种变种。研究中采用了两种荧光标记的适配体，K1（77个核苷酸）和M40（51个核苷酸），这两种适配体之前被报道具有对不同SARS-CoV-2变种刺突蛋白的广泛亲和力。我们使用了八种SARS-CoV-2变种进行检测实验，并通过与流感病毒的比较实验进一步评估了适配体的特异性。研究结果表明，NC-FPAA具备检测多种SARS-CoV-2变种的潜力，有望成为一种快速、简单且低成本的病毒检测工具，从而支持广泛的病毒监测工作。

在研究背景中，尽管SARS-CoV-2疫情在媒体报道中已不再占据主导地位，但病毒的持续变异使得新的变种不断出现。这些变种可能具有更高的传播力或更强的免疫逃逸能力，给公共卫生带来了持续的挑战。为了应对这一问题，世界卫生组织（WHO）在2024年启动了WHO冠状病毒网络（CoViNet），旨在跟踪新兴变种，以实现早期和准确的冠状病毒检测，并进行全面的风险评估。然而，大多数变异对病毒特性的影响较小或几乎没有，某些变异却可能影响病毒的传播力、疾病严重程度以及疫苗、治疗手段和诊断方法的有效性。因此，从诊断角度来看，迫切需要开发出能够同时检测特定变种和广泛变种的检测技术。目前，核酸检测方法如聚合酶链反应（PCR）和等温扩增技术（LAMP）具有较高的灵敏度，但它们通常需要复杂的实验步骤和较长的检测时间。相比之下，基于免疫检测的方法则通过检测病毒保守区域（如N基因和ORF1ab基因）或使用针对保守蛋白（如核衣壳蛋白）的抗体，能够降低变异对检测结果的影响，从而实现对多种变种的全面监测，维持诊断的可靠性，并支持长期的公共卫生管理。

为了满足这一需求，我们开发了一种非竞争性荧光偏振适配体检测方法（NC-FPAA），这种方法利用荧光标记的适配体作为检测探针。与传统的竞争性荧光偏振免疫检测（FPIA）不同，NC-FPAA不依赖于分析物与标记探针之间的竞争结合，而是通过适配体与目标分子结合后结构的变化来检测目标。这种方法具有操作简便、检测快速和成本低廉的优势，非常适合大规模筛查和长期监测。在本研究中，我们采用两种荧光标记的适配体K1和M40，它们已被证明能够广泛结合不同SARS-CoV-2变种的刺突蛋白。通过使用这些适配体，我们对八种SARS-CoV-2变种进行了检测实验，并进一步评估了其对流感病毒的特异性。实验结果显示，NC-FPAA在检测多种SARS-CoV-2变种方面表现出良好的性能，且在检测流感病毒时，M40适配体展现出较高的特异性，而K1适配体则表现出一定的交叉反应性。

为了进一步验证NC-FPAA的检测性能，我们对检测时间进行了评估。在检测SARS-CoV-2变种时，适配体K1在较长时间的孵育后显示出信号强度的轻微增加，但总体来看，信号强度在5分钟的孵育时间后已经趋于稳定，表明该方法可以在短时间内完成检测。结合样本引入微流控设备和测量过程，整个检测流程可以在大约7到8分钟内完成，这使其成为一种快速的检测手段。此外，我们还评估了该方法的检测灵敏度。尽管NC-FPAA具有操作简便和快速的优点，但其检测灵敏度仍有提升空间。通过使用纳米粒子追踪分析（NTA）测定病毒颗粒的浓度，我们发现当样本被稀释10倍时，检测变得困难，因此估计其检测限约为10^9颗粒/毫升。这一灵敏度水平足以检测高浓度的临床样本，但在低浓度样本或环境监测中可能不够理想。为此，研究者提出了多种可能的改进策略，例如使用多价适配体、选择具有更长荧光寿命的荧光标记，以及优化信号处理条件。这些策略的实施有望进一步提升NC-FPAA的检测灵敏度，从而增强其在实际应用中的价值。

在交叉反应性方面，我们特别关注了NC-FPAA在同时存在SARS-CoV-2和流感病毒时的性能。由于两种病毒都可能引起类似的症状，同时流行可能导致诊断和治疗的延误，并给医疗系统带来额外负担。因此，快速且准确地区分这两种病毒显得尤为重要。我们使用了两种流感病毒株（H1N1和H3N2）进行交叉反应性实验，并发现K1适配体对这两种病毒表现出一定的交叉反应性，而M40适配体则几乎没有反应。这一结果表明，M40适配体能够选择性地检测SARS-CoV-2变种，而不与其他病毒发生交叉反应。这种特异性对于在流感季节同时流行的病毒检测具有重要意义，同时也凸显了评估适配体特异性在实际应用中的必要性。

通过本研究，我们成功开发出了一种适用于多种SARS-CoV-2变种的非竞争性荧光偏振适配体检测方法（NC-FPAA）。该方法不仅能够在短时间内完成检测，而且具有较低的成本，适合大规模筛查和长期监测。尽管已有研究报道了NC-FPAA在检测病毒刺突蛋白方面的应用，但针对完整病毒颗粒的直接检测仍然较为有限。本研究通过使用实际的病毒样本，验证了NC-FPAA在检测完整病毒颗粒方面的可行性，并进一步评估了其对流感病毒的特异性。实验结果表明，NC-FPAA在检测SARS-CoV-2变种方面表现出良好的性能，特别是在使用M40适配体时，能够实现对多种变种的特异性识别。这些发现不仅为NC-FPAA在实际应用中的推广提供了依据，也为未来开发更广泛适用的病毒检测技术奠定了基础。

综上所述，NC-FPAA作为一种新型的病毒检测技术，具备快速、简便和低成本的优势，能够有效应对SARS-CoV-2病毒变种带来的挑战。通过选择合适的适配体，该方法不仅可以用于检测多种SARS-CoV-2变种，还可以在同时流行的情况下，准确区分不同的病毒类型。随着技术的不断优化和适配体的进一步筛选，NC-FPAA有望成为一种重要的病毒检测工具，为公共卫生监测和疾病防控提供有力支持。