通过代谢组学和生物测定方法研究来自巴西的蓝细菌的化学多样性

《ACS Omega》：Chemodiversity of Cyanobacteria from Brazil Investigated by Metabolomics and Bioassays

本研究对巴西19种蓝藻菌株的次级代谢产物进行筛选，结合生化和代谢组学方法，发现Calothrix和Phormidium属菌株产生具有抗菌、细胞毒性和抗利什曼原虫活性的新型代谢物，并通过LC-MS-GNPS-NP Analyst工具鉴定了潜在的新化合物。

　　在巴西，关于蓝藻次级代谢产物的研究仍然较为有限，尽管该国拥有丰富的生物多样性。本研究通过结合生物活性测试与非靶向代谢组学的方法，对来自巴西不同地区的19种蓝藻菌株进行了初步筛选，旨在发现具有潜在生物活性的化合物。蓝藻属于一个高度多样化的菌门，长期以来在生物技术领域的研究相对较少。虽然蓝藻常被关注其毒素的产生，但它们同样被认为是食品、化妆品和制药领域中重要生物活性化合物的来源。已知的蓝藻次级代谢产物显示出抗菌、抗肿瘤、抗寄生虫等多种治疗相关的特性。例如，Dolastatin 10这一化合物激发了多个抗体-药物偶联物的开发，如Brentuximab Vedotin，以及新的功能类似物。

巴西的国土面积约为851万平方公里，占据了全球约20%的生物多样性。然而，从巴西采集的蓝藻中仅报道了少量的天然产物，包括namalides B和C、spumigins K到N以及一些aeruginosins。在寻找新的天然产物的过程中，代谢组学作为一种强大的工具，已被用于辅助生物活性导向的分级分离、生物样本优先排序、次级代谢产物生物活性预测以及在天然产物分离初期进行重复鉴定。近年来，巴西蓝藻的毒理学和生物活性潜力通过代谢组学工具的使用得到了越来越多的探索，这些工具如GNPS、NP Analyst和DAFdiscovery等，能够进行高通量、深入的代谢组学分析，特别是在考虑到巴西多样的生态系统时。

本研究采用了生物活性测试与非靶向代谢组学相结合的方法，以探索巴西蓝藻的化学潜力。我们对巴西蓝藻培养物的分级提取物进行了抗菌、细胞毒性和抗利什曼原虫的活性测试，同时利用LC-MS技术优先筛选出具有生物相关性的特征，并有助于次级代谢产物的重复鉴定。通过这种方法，我们能够更有效地识别可能具有生物活性的化合物，从而推动对这些化合物的进一步研究。

在材料和方法部分，我们从巴西圣保罗州的蓝藻培养物收集中心（CCIBt）获得了19株蓝藻菌株，并将其转移到150毫升的培养基中进行传代培养，使用BG-0或BG-11培养基作为种子。随后，这些菌株在4.5升的培养基中进行大规模培养，并平均分配到三个2升的Erlenmeyer烧瓶中。培养条件为24摄氏度，保持无菌通气和30微摩尔光子/平方米/秒的光照射，在12小时光照和12小时黑暗的循环条件下进行培养。

在提取和分级阶段，经过8周的培养后，蓝藻细胞通过离心与培养基分离，并在冻干后进行三次萃取，使用CH2Cl2/MeOH（1:1）的混合溶剂。萃取物在旋转蒸发器中浓缩至37摄氏度，并通过固相萃取（使用Diaion HP-20SS作为固定相，以不同浓度的异丙醇（IPA）在水中进行梯度萃取）进行预分级。萃取物和分级后的样品被溶解于甲醇中，制备成10毫克/毫升的储备液，然后取10微升（对应100微克样品）进行生物活性测试。

在细胞毒性测试中，我们使用MTT法对HCT-116（结肠癌）和MCF-7（乳腺癌）细胞系进行了评估。细胞被种植在96孔板中，每个孔中包含2×10^3个细胞（HCT-116）或8×10^3个细胞（MCF-7），细胞密度为1×10^4个/毫升或4×10^4个/毫升。样品被溶解在DMSO中，制备成50和5微克/毫升的最终测试浓度。在24小时的生长后，细胞被暴露于样品中，并在无氧条件下孵育72小时。随后，将MTT溶液加入培养基中，孵育3小时后，去除上清液，将沉淀物溶解于DMSO中，并在570纳米波长下测量吸光度。使用多柔比星作为阳性对照，DMSO作为阴性对照，样品被判定为细胞毒性，当其在50微克/毫升浓度下抑制细胞生长70%以上或在5微克/毫升浓度下抑制50%以上。

在抗菌活性测试中，我们使用CLSI标准，针对五种临床相关的细菌菌株进行了测试，包括大肠杆菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）和产碱假单胞菌（ATCC 14764）。细菌菌落被接种于调整后的Mueller-Hinton肉汤中，随后将菌悬液调整至0.5 McFarland标准（约1.5×10^8 CFU/毫升），并进一步稀释至每个孔5×10^5 CFU/毫升。样品被溶解在DMSO中，以3.3微升/孔的量加入，产生最终浓度为50微克/毫升的样品溶液（3.3% DMSO）。测试中，96.7微升的标准化菌悬液被加入每个孔，随后加入3.3微升的样品溶液。阴性对照仅包含DMSO（3.3%），而阳性对照使用美罗培南（100微克/毫升）。培养板在37摄氏度下孵育18至24小时，通过测量600纳米波长的光密度来监测细菌生长。生长抑制被表示为相对于阴性对照的百分比，样品被判定为生物活性，当其在50微克/毫升浓度下抑制细菌生长70%以上。

在抗利什曼原虫活性测试中，我们使用了巴西利什曼原虫（L. amazonensis）的静止期原虫，将其离心后重悬于无酚的RPMI 1640培养基中，并接种于96孔板中，每孔10^7个原虫（100微升/孔）。样品被溶解在DMSO中，以50微克/孔的量加入，最终浓度为25微克/毫升（0.5% DMSO）。测试中，50微克的样品被加入到RPMI培养基中，并与原虫悬液混合。培养板在26摄氏度下孵育48小时。阴性对照使用培养基，而阳性对照使用100微摩尔的DMSO。在24小时和48小时后，通过Alamar blue检测原虫的活力。吸光度在690和600纳米波长下测量，活力被表示为相对于阴性对照的百分比。样品被判定为生物活性，当其在25微克/毫升浓度下抑制原虫生长70%以上。

在LC-MS分析中，所有分级后的样品均通过超高效液相色谱-高分辨率质谱和串联质谱（MS/MS）进行分析。液相色谱-质谱数据使用Waters Acquity UPLC H-class设备与Waters Xevo G2-XS QToF质谱仪结合，通过电喷雾电离（ESI）在总离子扫描模式下进行采集。色谱分离使用了2.1×50毫米的Kinetex C18柱（Phenomenex），粒径为1.7微米。流动相由LC-MS级的H2O（A）和MeCN（B）组成，两者均酸化为0.1%的甲酸。梯度程序从10%到100% B线性增加7分钟，随后保持100% B 1分钟，快速返回到10% B（0.1分钟），最后保持10% B 1.9分钟。设备的操作参数包括1200伏的毛细管电压、30电子伏特的锥形电压、100摄氏度的离子源温度、450摄氏度的脱溶剂温度、50升/小时的氮气流速、750升/小时的脱溶剂气体流速、质量检测范围为100至2000道尔顿、0.2秒的扫描时间、以及碰撞能量范围为15至30电子伏特和60至80电子伏特。为了获得碎片光谱（MS/MS），每个MS1光谱中选择三个最强烈的离子进行碎片化。

在HPLC-UV-MS分析中，我们使用Waters HPLC-UV-MS系统（2695 Alliance模块、2696 PDA检测器和Micromass ZQ2000质谱仪）对anabaenopeptins进行了分析。色谱分离使用了XTerra RP18柱（250×4.6毫米、5微米）和RP18保护柱（4×3毫米），使用有机相（1:1 MeOH/MeCN，均含0.1%甲酸）的线性梯度（10–100%）在30分钟内进行。水相也含有0.1%甲酸。流速为1.0毫升/分钟。紫外检测在200至700纳米范围内进行。质谱在ESI正负模式下运行（m/z 400–1600），设置包括3千伏的毛细管电压、100摄氏度的源温度、350摄氏度的脱溶剂温度、50升/小时的锥形气体流速、350升/小时的脱溶剂气体流速。真实标准品和样品被单独分析。通过将标准品和样品进行混合实验，以确认保留时间和MS图谱。

在NP Analyst代谢组学分析中，LC-MS数据被导入Progenesis QI软件（Waters，马萨诸塞州米尔福德市）进行对齐、峰选择、归一化和解卷积，使用最小强度为100,000和最小宽度为0.1分钟的参数。处理后的数据文件和对应的.csv元数据文件（包含化合物强度和注释）被导出并重新格式化，以便上传到NP Analyst，使用内部Python脚本进行。生物活性结果被合并到一个单独的csv文件中。数据通过以下参数进行分箱和归一化（0到1评分）：生物活性值在0到0.25之间为0；在0.25到0.7之间为0.5；在0.7到1之间为1。NP Analyst流程用于化合物活性映射，使用活性评分2和聚类评分0.5进行分析（关于活性和聚类评分的定义请参见参考文献）。这些结果允许检测可能与观察到的活性相关的特征。

在GNPS分子网络分析中，原始LC-MS数据被转换为.mzXML格式，使用MSConvert（ProteoWizard）进行预处理，并使用MZMine版本2.53进行。预处理参数包括质量检测：MS1；噪声水平：10^5；MS/MS噪声水平：10^1；最小时间跨度：0.01分钟；色谱图构建器：最小高度2×10^5 m/z；容差20 ppm；色谱图解卷积；m/z范围用于MS/MS扫描配对：1 Da；RT范围用于MS/MS扫描配对：0.15分钟；m/z容差用于同位素峰分组：20 ppm；RT容差：0.1；最大电荷：3；代表性同位素：最强烈的。文件被导出为.mgf文件，并用于分子网络分析。通过GNPS网站的经典工作流程创建了一个分子网络（https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task=e7f28fb1024c479b88ae7eb17ff6e482）。数据通过移除所有与前体m/z在±17 Da范围内的MS/MS碎片离子进行过滤。MS/MS光谱通过选择每个光谱中前6个碎片离子在±50 Da范围内的光谱进行窗口过滤。前体离子质量容差设置为0.02 Da，MS/MS碎片离子容差设置为0.02 Da。网络通过设置边的余弦分数高于0.55且匹配峰超过5个进行创建。进一步，只有当两个节点在彼此的前10个最相似节点中时，才在分子网络中保留边。分子家族的最大大小设置为100，最低评分的边从分子家族中移除，直到分子家族大小低于此阈值。网络中的光谱随后与GNPS光谱库进行搜索。网络（https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task=e7f28fb1024c479b88ae7eb17ff6e482）通过Cytoscape 3.6.1软件进行可视化。LCMS数据被存入MassIVE（MSV000099122）。

在SIRIUS注释中，我们使用SIRIUS 5.8对优先特征的分子式和化学类别进行了确定。SIRIUS的参数包括通用仪器（Q-ToF）、MS/MS质量精度（10 ppm）、MS/MS同位素评分（评分）、候选存储（20）、仅使用数据库进行公式注释（无）、允许的分子式元素（H、C、N和O）。CSI:FingerID指纹预测：回退加合物（所有）、搜索数据库（所有）；标签脂质（关闭）；CANOPUS（开启）。除了使用CANOPUS进行重复鉴定外，还进行了手动搜索，包括Chemspider、SciFinder、Metlin、天然产物词典、NPAtlas、CyanoMetDB以及我们内部的数据库。这些结果有助于确认优先特征的分子式和化学类别。

在结果和讨论部分，我们创建并筛选了一个蓝藻分级库。19株蓝藻菌株来自5个属，分别是Calothrix（n=5）、Geitlerinema（n=2）、Leptolyngbya（n=3）、Nostoc（n=4）和Phormidium（n=5）。图1显示了每株菌株的来源位置。只有其中6株菌株在之前的研究所涉及。例如，菌株CCIBt3241、CCIBt3248和CCIBt3280曾被研究其抗氧化潜力及蛋白质、碳水化合物和脂质含量，结果各异。菌株CCIBt3247在暴露于紫外线3天后显示出porphyra-334的产生。菌株CCIBt3278和CCIBt3280被证实为乙酰胆碱酯酶抑制剂。菌株CCIBt3324曾被研究其microginins的产生，但结果为阴性。菌株CCIBt3324和CCIBt3247曾被研究其对Artemia salina的活性，仅CCIBt3324显示出中等细胞毒性。

在本研究中，12株蓝藻菌株的样品在50微克/毫升浓度下显示出对P. aeruginosa的抑制活性。7株菌株的分级样品显示出对S. aureus的抗菌活性。仅CCIBt3324菌株的分级样品显示出对S. marcescens的显著生物活性。在抗利什曼原虫测试中，显示出抑制活性的菌株包括CCIBt3095、CCIBt3247、CCIBt3278、CCIBt3280、CCIBt3304和CCIBt3582。粗提取物未显示出超过70%的活性，这进一步强调了分级在提高生物活性筛选命中率方面的重要性。

在代谢组学用于样品优先筛选和重复鉴定以确定化学新颖性部分，我们使用NP Analyst对归一化的生物活性结果和LC-MS数据进行了分析。通过将代谢组学谱图与生物活性读数整合，NP Analyst预测哪些化合物可能负责观察到的生物活性。它计算了两个主要指标：活性评分，反映表型强度；聚类评分，表示化合物在生物活性分级中的普遍性。通常，评分较高的分子或MS1代谢组学数据集中的特征会被优先隔离。NP Analyst还提供了一套可视化、比较和探索工具，以支持新化合物的发现或潜在已知化合物的重复鉴定。值得注意的是，潜在的生物活性特征及其对应的活性和聚类评分可以在生物活性网络中进行可视化，展示其生物活性潜力和在样本集中的分布情况。MS数据与粗提取物未被包括在此分析中。

生物活性网络由节点组成，方块节点代表样本，圆形节点代表质谱特征，通过边连接，表示特征在样本中的存在。每个圆圈传达两个关键指标：较深的红色表示较高的预测生物活性（活性评分），较大的直径反映MS特征活性谱的较高一致性（聚类评分）。因此，颜色较深且直径较大的圆圈表明，对应的m/z比更有可能与特定的生物活性相关，基于计算的聚类和活性评分。NP Analyst为每个蓝藻菌株的分级提取物鉴定出的生物活性特征数量总结在支持信息表S4中。对于此分析，活性和聚类评分阈值分别为0.5和2。

NP Analyst的生物活性网络揭示了八个不同的代谢物群体，每个群体代表具有相似生物活性谱的化合物（图3）。这些群体使用Louvain方法进行分组，该方法根据节点的相互连接性将大型网络划分为较小的群体。这种图形可视化在优先筛选潜在生物活性特征方面证明了其价值。群体1和群体2在生物活性结果中最为突出，即使使用5微克/毫升的浓度，所有群体均被重复鉴定，详细信息在图S1–S6和表S5中。

群体1包括在菌株Calothrix sp. CCIBt3582的分级F1、F2、F3和F4中检测到的MS特征。NP Analyst突出的两个特征，m/z 1400.7075 [M + H]+在3.36分钟和m/z 1414.7234 [M + H]+在3.43分钟，被建议与对S. aureus和P. aeruginosa的抗菌活性以及对HCT-116和MCF7细胞系的细胞毒性相关，如高活性（2.26和3.31）和聚类（0.53和0.54）评分所示（图4a）。使用SIRIUS计算的分子式分别为C63H98N15O21+和C64H100N15O21+。CANOPUS将这些化合物分类为环状脱肽，而NPAtlas数据库中未记录匹配项。

群体2由菌株Phormidium sp. CCIBt3280的分级F2、F3、F4和F5中的三个特征组成，这些特征在NP Analyst网络中显示出高活性和聚类评分，与对抗P. aeruginosa、利什曼原虫以及HCT-116和MCF7细胞的抗菌活性相关（图4）。SIRIUS计算的分子式分别为C64H95N12O19+、C71H104N13O21+和C73H108N13O21+。CANOPUS将这些化合物分类为潜在的肽，并揭示了特征m/z 1502.7771 [M + H]+与lyngbyazothrin D/portoamide B（计算m/z 1502.7777 [M + H]+）的相似性为63.67%。这些差异可能反映不同的氨基酸组成或残基序列的变化。

群体3由在多个菌株中检测到的特征组成，其中大多数特征来自菌株Calothrix sp. CCIBt3585。根据NP Analyst的结果，与生物活性相关的特征在5.52和5.83分钟时洗脱，并显示m/z为639.2822 [M + Na]+的钠加合物二聚体m/z为1299.5262 [2M + Na]+，以及m/z为653.2988 [M + Na]+的钠加合物二聚体m/z为1327.5590 [2M + Na]+，被描述为化合物6和7。群体3中检测到的潜在异构体在图S1中得到了证实。SIRIUS和CANOPUS分析表明，化合物6的分子式为C23H40N10O10+，而化合物7的分子式为C40H42N2O5+，分别被分类为氨基环醇糖苷和四吡咯衍生物，质量误差分别为Δ +0.15 ppm和Δ +0.45 ppm。由于这些特征在不同菌株中被检测到，我们推测它们可能代表初级代谢物。

群体4中的自动注释显示，anabaenopeptins和aeruginosins是可能负责观察到的生物活性的化合物。使用CyanoMetDB、NP Atlas和SIRIUS软件对所有节点进行重复鉴定（图7）。通过比较文献中描述的已知anabaenopeptins的光谱数据，我们能够将从Nostoc sp. CCIBt3291样品中检测到的化合物与已知的anabaenopeptins进行比较。例如，检测到的anabaenopeptin B（m/z 837.4617 [M + H]+）与文献中的anabaenopeptin B的分子式C41H59N7O9+相符。而检测到的anabaenopeptin F（m/z 851.4770 [M + H]+）的分子式为C41H61N7O9+，与文献中的anabaenopeptin F相符。这些化合物的洗脱时间与标准品一致，通过比较保留时间和MS数据确认了其身份。anabaenopeptin B在11.9分钟洗脱，anabaenopeptin F在12.3分钟洗脱，后者比前者更为丰富。这些化合物的MS1光谱显示在图S16中。

通过这种分析，我们确认了从Calothrix sp.（CCIBt3581）中提取的anabaenopeptins B和F，使用真实标准品进行比较（一级注释）。相比之下，大多数来自Phormidium sp.（CCIBt3280）的anabaenopeptins和来自Nostoc sp.（CCIBt3291）的aeruginosins被初步鉴定（二级注释），除了aeruginosin 848，仅达到三级注释。对于潜在的新aeruginosins，MS/MS数据允许结构建议，将其归类为二级注释。图7突出了这些注释的化合物。

在群体4的NP Analyst分析中，我们发现anabaenopeptins和aeruginosins可能是导致观察到的生物活性的化合物，它们在P. aeruginosa、L. amazonensis和HCT-16细胞中的生物活性和聚类评分各有不同。通过将分级策略与代谢组学工具如NP Analyst、SIRIUS和GNPS相结合，我们成功鉴定了20个可能与观察到的生物活性相关的特征。这种方法提高了化合物选择和优先级的效率，简化了生物活性代谢物的识别过程。文献中还报告了其他天然产物的优先策略。例如，Olivon等人通过分子网络图谱展示了生物活性数据与分类信息之间的相关性。另一种有前景的方法是使用结合生物活性、质谱（MS）和核磁共振数据的工具，如DAFdiscovery。该平台也利用生物活性、光谱和光谱数据来识别化学和生物数据集中的模式，从而促进新型生物活性天然产物的发现。因此，我们的研究结果提供了一种功能性和整合性的策略，结合了不同的技术来优先选择感兴趣的天然产物。此外，我们强调了巴西采集的蓝藻在化学和生物活性方面的丰富性，突出了它们在寻找新的抗菌、细胞毒性和其他生物活性化合物方面的生物技术潜力。通过结合代谢组学工具，我们能够根据MS1数据和生物活性以及MS/MS光谱比较来优先选择特征，这进一步增强了巴西蓝藻中特征的选择。