重构抗病毒喹唑啉酮骨架以合成并优化基孔肯雅病毒抑制剂

《ACS Medicinal Chemistry Letters》：Restructuring Antiviral Quinazolinone Frameworks to Derive and Optimize Inhibitors of Chikungunya Virus

寨卡病毒（CHIKV）导致严重慢性疼痛，现有疫苗和疗法有限。本研究通过结构优化开发新型喹唑啉酮抑制剂（R）-1h（BDGR-651），其 EC50 为0.86 μM，显著抑制病毒复制且微s和血浆稳定性优异，但选择性指数限制体内评估。研究揭示了喹唑啉酮骨架可适配不同病毒，为应对气候变化导致的病毒扩散提供新思路。

　　近年来，寨卡病毒（Chikungunya virus, CHIKV）因其传播广泛、感染症状严重以及缺乏有效的治疗手段而受到广泛关注。CHIKV是一种由蚊子传播的正链单股RNA病毒，属于甲病毒科。该病毒引起的疾病以剧烈的肌肉和关节疼痛、疲劳、头痛、恶心和皮疹为特征。尽管多数患者在感染后几周内症状会逐渐缓解，但约有40%的患者会经历持续数月甚至数年的慢性关节疼痛，严重影响生活质量。由于CHIKV具有快速传播、可能引发全球大流行以及导致严重人类疾病的能力，它被列为优先关注的病原体之一。

目前，虽然已有两种疫苗被批准使用，但针对CHIKV的治疗药物仍处于空白状态。因此，研究人员对化合物库进行了筛选，以寻找具有抗病毒潜力的候选分子。其中，一种名为（S）-1a的喹唑啉酮类化合物表现出一定的抗病毒效果，能够将病毒滴度降低约0.3个对数单位，同时在细胞毒性方面未见显著影响（CC50 > 40 μM）。为了进一步提升其抗病毒效果，研究团队对五个结构区域进行了系统优化，以提高病毒滴度的减少效率。此外，研究还开发了化学方法，以保持含有2-哌啶基的类似物的对映体纯度，从而获得了（R）-1h（BDGR-651），该化合物在正常人真皮成纤维细胞中，以10 μM浓度处理时，能够将CHIKV滴度降低4.1个对数单位（EC50 = 0.86 μM），表现出显著的抗病毒活性。

研究还观察到（R）-1h具有良好的溶解性以及小鼠微粒体和血浆稳定性，通过共聚焦显微镜对感染的Vero E6细胞进行观察，结果显示（R）-1h在不同剂量下表现出剂量依赖性的保护作用。然而，由于其选择性指数较窄，限制了其在动物模型中的进一步研究。尽管如此，研究团队发现，针对脑炎甲病毒的喹唑啉酮类化合物可以经过结构优化后，用于抑制CHIKV这一引起关节炎的病毒，而此前的类似物对此几乎没有显著效果。

为了深入研究这些化合物的结构与活性之间的关系（Structure-Activity Relationship, SAR），研究团队对喹唑啉酮核心结构进行了广泛的修饰。他们首先生成了多种N-叔丁氧羰基保护的喹唑啉酮中间体，并在此基础上进行进一步的结构多样化。所有类似物均基于市售的苯甲酸衍生物2a–2c构建。随后，研究团队采用了实验室开发的、铜催化的三步一锅法，以保持手性氨基酸衍生物在喹唑啉酮核心合成过程中的立体化学特性。对于某些中间体（如4a–4c），需要额外的步骤，使用N,O-双三甲基硅基乙酰胺完成双酰胺前体的环合反应，而另一些中间体（如4d–4k）则可以直接进行环合。对于那些在铜催化条件下无法形成或缺乏立体中心的N3-芳基化合物（如4l–4m），则采用了更剧烈的条件，使用三苯基膦进行反应。对于含有N3-甲基取代基的化合物4n，研究团队通过苯甲酸与甲基酰胺的偶联反应，最终得到喹唑啉酮结构。

为了评估化合物的抗病毒活性，研究团队在细胞水平上进行了一系列实验，使用CHIKV（株181/25mKate）在正常人真皮成纤维细胞（NHDF）中进行病毒滴度减少试验。每种化合物均以10 μM浓度测试三次，并与未处理的DMSO对照组和未发表的阳性对照药物SRI-42718（一种针对CHIKV nsP4聚合酶的抑制剂）进行比较。在感染后72小时，通过立体显微镜对病毒斑块进行计数。部分化合物在不同浓度下进一步测试，以确定其EC50值。同时，研究团队也评估了化合物对细胞的毒性，以确保其在治疗应用中的安全性。

在结构优化过程中，研究团队发现，将哌啶基的N-甲基取代基替换为更具空间位阻的N-异丙基取代基后，病毒滴度的减少效果显著提升。例如，（R）-1d在10 μM浓度下能够将病毒滴度降低约200个对数单位，而其细胞毒性则相对较低。然而，当哌啶基的N-取代基被替换为氢原子时，抗病毒活性有所下降，同时细胞毒性依然存在。此外，对于更长的哌啶基衍生物或非环状结构，其抗病毒效果并未得到明显改善。这些结果表明，哌啶基的N-取代基对病毒滴度的减少具有重要影响。

为了进一步探索喹唑啉酮结构对CHIKV的抑制潜力，研究团队对C6位置的卤素取代基进行了系统研究。例如，将C6位置的氟原子替换为氯原子后，抗病毒活性显著增强，但细胞毒性仍然存在。这些结构变化为后续优化提供了重要线索。同时，研究团队还发现，C7位置的胺基取代基对病毒滴度的减少具有显著影响，某些结构优化后能够显著提升抗病毒效果，同时保持良好的细胞选择性。这些结果表明，CHIKV的抗病毒活性不仅依赖于C6和C7的结构变化，还可能受到其他结构区域的影响。

此外，研究团队对喹唑啉酮核心的合成方法进行了优化，以提高其对映体纯度。在之前的合成过程中，铜催化的反应条件未能有效保留2-哌啶基类似物的立体化学特性，导致产物出现一定程度的异构化。因此，研究团队开发了新的合成策略，通过分步反应完成喹唑啉酮的环合，同时避免了对映体的异构化。例如，使用HATU促进苯甲酰胺的形成，随后通过POCl3进行第二步酰胺化反应，以保留起始材料和中间体的对映体纯度。这些优化措施显著提高了产物的产率和对映体纯度，为后续的药物开发奠定了基础。

在进一步的实验中，研究团队对（R）-1h和（R）-1z的各个对映体进行了评估，发现（R）-1h在抗病毒效果和细胞毒性方面表现出最佳的平衡。例如，在NHDF细胞中，（R）-1h能够将病毒滴度降低4.1个对数单位，同时细胞毒性较低（CC50约为19 μM）。这些结果表明，（R）-1h具有较高的抗病毒活性和良好的安全性，是当前研究中的重要候选药物。

研究团队还对（R）-1h的体外药代动力学和药物代谢（ADME）特性进行了初步评估。结果表明，（R）-1h在小鼠血浆中具有良好的溶解性和稳定性，其半衰期超过240分钟，同时血浆蛋白结合率较高，达到76.8%。这些特性为（R）-1h的进一步优化提供了重要依据。尽管（R）-1h的选择性指数较窄，限制了其在动物模型中的进一步研究，但其良好的药代动力学特性表明，未来通过结构优化可能进一步提升其选择性，从而实现更有效的治疗。

研究团队还发现，CHIKV与脑炎甲病毒（如VEEV和EEEV）在结构上存在显著差异。例如，CHIKV的喹唑啉酮类似物中，C6位置的硝基取代基被替换为卤素原子，这与已知的用于抑制脑炎甲病毒的喹唑啉酮结构不同。因此，研究团队推测，CHIKV的喹唑啉酮类似物可能具有不同的作用机制。这一假设将在未来的研究中进一步验证，以明确其作用靶点和分子机制。

此外，研究团队指出，随着全球气候变化，蚊子的迁徙范围扩大，CHIKV的传播范围也逐渐扩展至美洲、欧洲和加勒比海地区，以及太平洋和印度洋。这意味着全球范围内对CHIKV的感染风险正在上升，特别是对于经常旅行的地区和脆弱人群。因此，开发针对CHIKV的新型治疗药物具有重要意义，不仅有助于缓解感染症状，还能减少慢性关节疼痛的发生率。

研究团队强调，尽管当前的喹唑啉酮类化合物在抗CHIKV方面表现出一定的效果，但仍需进一步优化以提高其抗病毒活性和安全性。例如，通过调整C6和C7的结构，可以显著增强其抗病毒效果，同时减少细胞毒性。此外，研究团队还计划进一步研究这些化合物在体内的药代动力学特性，以评估其在动物模型中的实际应用效果。这些研究将为未来开发针对CHIKV的高效、安全的治疗药物提供重要支持。

总之，CHIKV的抗病毒药物开发是一个复杂且多步骤的过程，涉及结构优化、合成方法改进以及药代动力学和药物代谢特性评估。尽管目前的研究已经取得了一些进展，但仍需进一步探索以提高其抗病毒效果和选择性。未来的工作将集中在对N3芳基取代基和C7、C8结构的进一步优化，以及研究其作用机制和抗病毒靶点。这些研究不仅有助于理解CHIKV的生物学特性，还可能为开发新的抗病毒药物提供重要的理论基础和实践指导。