基于化合物分离的生物活性代谢组学的高频微流控分离技术

《Analytical Chemistry》：High-Frequency Microfluidic Fractionation for Compound-Resolved Bioactivity-Based Metabolomics

快速鉴定复杂提取物中抗生素活性成分的LC-MS/MS耦合微流控代谢组学方法。采用定制高速微流控分样设备（Microspotter）与μPAD联用，在LC-MS/MS运行中同步实现500个微分数点的生物活性检测，通过五组特异性响应抗生素作用机制的生物报告菌株（检测DNA合成、细胞壁完整性、翻译抑制等通路），结合荧光强度与质谱特征谱的保留时间匹配，实现纳克级灵敏度（最高达1 ng/spot）的活性成分筛选。方法成功从放线菌S. erythraea粗提物中鉴定出厄里希霉素A及其衍生物，并通过分子网络分析实现结构 dereplication。

　　在当前全球面临抗生素耐药性挑战的背景下，寻找新的抗生素来源变得尤为迫切。自然产物，特别是由微生物产生的特殊代谢物，一直是药物开发的重要资源。然而，从原始代谢物提取物中检测到生物活性，再到明确识别出具有活性的化合物，这一过程往往繁琐且成本高昂。为了应对这一关键的生物分析挑战，我们开发了一种结合非靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）、微流控设备上的高频分馏以及后续使用发光生物报告菌株进行检测的化合物解析型生物活性代谢组学工作流程。该方法通过在色谱分离的同时进行高频率的微分馏，并将这些分馏样本与生物报告菌株进行结合，实现了对生物活性信号的高精度检测和分析。这一创新方法不仅提高了筛选效率，还为从复杂样本中快速识别具有生物活性的化合物提供了新的可能性。

该方法的核心在于一种自定义的高速分馏设备，能够以约1 Hz的频率将流动相分馏至微流控纸基分析设备（μPAD）上，同时进行LC-MS/MS数据采集。这种同步分馏与检测的方式确保了生物活性信号与质谱信号之间的精确关联。随后，μPAD被覆盖上含有生物报告菌株的琼脂，这些菌株在受到抗生素影响时，会通过表达荧光素酶来产生光信号，从而指示细胞应激反应。通过分析这些光信号与质谱数据的色谱特征，我们可以更准确地识别出具有生物活性的化合物。该方法的优势在于其高灵敏度和高通量特性，能够快速从复杂代谢物中筛选出多个抗菌化合物，而无需传统的低通量筛选方法。

为了进一步验证这一方法的实用性，我们使用了已知的抗生素生产菌株Saccharopolyspora erythraea的粗提取物进行测试。通过将提取物分馏到μPAD上，并与不同的生物报告菌株进行结合，我们成功地识别出了多种具有抗菌活性的代谢物，包括已知的红霉素及其衍生物。这表明，该方法不仅适用于标准抗生素的检测，也适用于从复杂生物样本中发现新型抗菌化合物。

在实验过程中，我们使用了多种技术手段来提高方法的准确性和效率。首先，通过微流控纸基分析设备（μPAD）实现高频率的微分馏，使得每个色谱峰都能被精确地捕获和分析。其次，我们开发了一种自定义的高速分馏设备（Microspotter），它基于商业的CNC铣床，通过三轴运动实现精确的分馏位置控制。此外，我们还设计了一种专门的软件工具MicrospotReader，用于处理和分析生物发光信号与质谱数据之间的关系。该软件能够将生物发光图像转化为生物活性色谱图，并将其与质谱数据进行比对，从而筛选出具有生物活性的化合物。

为了确保生物报告菌株的特异性，我们使用了一组50种具有明确作用机制的抗生素作为验证样本。这些样本被分馏到μPAD上，并与相应的生物报告菌株进行结合。通过观察生物发光信号的强度和分布，我们能够确定每种抗生素对不同生物报告菌株的特异性影响。例如，PfabHB-lux菌株对脂肪酸合成抑制剂表现出显著的响应，而PypuA-lux菌株则对细胞壁和膜干扰剂更为敏感。这些结果不仅验证了生物报告菌株的特异性，也为后续的分子网络分析提供了可靠的生物活性数据。

在数据处理方面，我们采用了一种基于Python的Web应用MicrospotReader，结合了NumPy、pandas、SciPy、scikit-image和pyOpenMS等工具，实现了对生物发光图像和质谱数据的自动化分析。该软件能够通过密度分析确定每个分馏点的生物活性水平，并将其转化为生物活性色谱图。同时，它还能将这些生物活性信号与质谱数据中的特征进行比对，从而识别出可能具有生物活性的化合物。此外，我们还利用GNPS2平台进行分子网络分析，通过比较不同化合物的质谱特征，发现了一些具有相似结构的代谢物，进一步支持了我们的生物活性检测结果。

为了评估该方法的检测灵敏度，我们对不同抗生素进行了2倍稀释系列实验，并手动将其分馏到μPAD上。通过比较生物发光信号与传统抑制区测试的灵敏度，我们发现该方法在低浓度下的检测能力更强。例如，红霉素的检测限为1 ng/spot，而其他抗生素如莫西沙星、红霉素E等也有不同的检测限。这一结果表明，我们的方法在检测低浓度生物活性化合物方面具有显著优势，能够更早地识别出潜在的药物候选物。

在实际应用中，我们对Saccharopolyspora erythraea的粗提取物进行了筛查，并成功识别出了红霉素A及其衍生物。通过将这些提取物分馏到μPAD上，并与相应的生物报告菌株进行结合，我们不仅能够确定这些化合物的生物活性，还能通过分子网络分析进一步确认其结构和作用机制。这一过程展示了该方法在实际药物发现中的强大功能，为从复杂生物样本中快速识别和验证生物活性化合物提供了有效的工具。

综上所述，我们开发的化合物解析型生物活性代谢组学工作流程，结合了微流控技术、高速分馏和生物发光检测，为抗生素和其他生物活性化合物的发现提供了新的方法。该方法不仅提高了筛选效率，还增强了对复杂代谢物样本的解析能力，为未来的药物发现和生物学研究奠定了坚实的基础。通过这一创新方法，我们有望在更短的时间内发现更多具有潜在药用价值的代谢物，从而加速新药的研发进程。