铁蛋白纳米笼中肽核酸封装用于基因沉默应用的评估

《Biomacromolecules》：Evaluation of Peptide Nucleic Acid Encapsulation in Ferritin Nanocages for Gene Silencing Applications

本研究利用带正电的PA3.2链修饰人类化古菌铁蛋白（HumAfFt），成功实现了对负电性肽核酸（PNAs）的高效封装与pH/温度响应性释放。通过合成不同电荷和长度的PNAs（如E4、E8、K6及19-mer E4），发现E8（-）负载效率最高（20.3%），且在酸性条件（pH 5.0）下释放效率达81.5%。细胞实验表明，封装的PNA能有效沉默GAPDH基因（抑制率45%），且优于游离PNA和传统siRNA递送系统。该体系为开发靶向递送系统提供了新策略。

　　肽核酸（PNA）是一种具有中性肽类骨架的核酸类似物，其独特的化学结构赋予了它对DNA和RNA的特异性结合能力，同时提高了其对核酸酶和蛋白酶的抵抗力。这些特性使PNA在分子诊断和精准医学领域具有广泛的应用前景。然而，PNA在生物医学应用中仍面临挑战，主要是其在水中的溶解性差和细胞渗透性低。因此，研究如何有效封装和释放PNA成为开发其治疗潜力的关键。

为了克服PNA的这些局限性，研究人员提出了一种创新的封装策略，即利用带有正电荷的蛋白质载体，通过双价阳离子触发的寡聚化技术进行封装。在此研究中，科学家们选用了一种经过基因改造的“人类化”古菌球蛋白（HumAfFt），这种蛋白因其独特的结构和生物相容性，被认为是理想的纳米载体。HumAfFt蛋白具有8纳米的内部空间，能够有效容纳分子，并且其表面的半胱氨酸残基允许使用化学试剂进行永久性修饰，从而实现对内部空间的定制化处理。

研究团队合成了一系列具有不同长度和电荷的PNA分子，并将其封装入HumAfFt蛋白腔体内。通过调整PNA的电荷状态，他们发现负电荷PNA在特定条件下具有更高的封装效率。这可能是由于封装过程中电荷相互作用促进了PNA与蛋白腔体之间的结合。研究还表明，即使在较高的封装比例下，负电荷PNA仍然能够保持纳米颗粒的尺寸稳定，这在细胞摄取和后续释放中尤为重要。

为了评估封装效果，研究人员采用了多种分析方法，包括动态光散射（DLS）、ζ电位和原位凝胶电泳（Native-PAGE）。这些方法帮助确定了封装后的纳米颗粒的大小、电荷状态以及结构完整性。结果显示，封装后的纳米颗粒保持了HumAfFt的原有结构，并且在封装过程中形成了稳定的复合物。同时，研究人员还观察到，封装后的PNA在特定的酸性条件下释放效率显著提高，这一特性可能对靶向药物递送具有重要意义。

在细胞摄取实验中，研究团队使用了荧光标记的PNA，并通过流式细胞术分析了其在细胞内的分布情况。实验结果显示，只有封装在HumAfFt纳米颗粒中的PNA才能有效进入细胞，而未封装的PNA则无法进入，这表明纳米颗粒在细胞摄取过程中起到了关键作用。此外，研究人员还验证了PNA在癌细胞中的基因沉默效果，发现封装后的PNA能够有效降低GAPDH基因的表达水平，与传统的siRNA相比，其效果接近甚至在某些情况下更优。

研究团队进一步探讨了不同电荷状态的PNA在封装和释放过程中的表现。例如，PNA10-mer E4（负电荷）在封装过程中表现出较高的效率，而PNA10-mer K6（正电荷）则由于与未修饰的HumAfFt之间缺乏有效的相互作用，其封装效率较低。此外，研究还发现，封装后的PNA在不同pH条件下的释放行为具有显著差异，特别是在酸性环境下，释放效率显著提高。这一特性可能被用于设计靶向特定细胞或组织的药物递送系统，尤其是在肿瘤微环境中，其中pH值通常低于正常细胞。

研究团队还对封装后的纳米颗粒进行了详细分析，以确保其在生理条件下的稳定性和生物相容性。实验结果表明，封装后的纳米颗粒不仅保持了HumAfFt的结构完整性，而且在封装过程中不会引起明显的结构变化。这为PNA在生物医学中的应用提供了有力的支持，尤其是在需要精准靶向和控制释放的治疗场景中。

此外，研究团队还探讨了不同长度的PNA在封装过程中的表现。例如，PNA19-mer E4（负电荷）由于其较大的尺寸和较高的刚性，其封装效率较低，仅能封装约0.8个分子/蛋白。这表明，纳米颗粒的内部空间和结构对PNA的封装能力具有重要影响，因此在设计PNA时需要考虑其长度和结构特性。

研究还涉及了PNA的生物活性评估，特别是其在癌细胞中的基因沉默效果。实验结果显示，封装后的PNA能够有效降低GAPDH基因的表达水平，而未封装的PNA则没有表现出类似的活性。这一发现表明，封装不仅有助于提高PNA的细胞摄取率，还能增强其在细胞内的生物活性，从而提高治疗效果。

综上所述，这项研究为PNA的封装和释放提供了一种新的策略，即利用双价阳离子触发的寡聚化技术将PNA封装入带有正电荷的HumAfFt蛋白腔体中。这种方法不仅提高了PNA的封装效率，还增强了其在细胞内的摄取和生物活性。研究结果表明，HumAfFt作为一种可修饰的纳米载体，具有良好的生物相容性和结构可控性，能够有效封装和释放PNA，从而为PNA在精准医学和分子诊断中的应用提供了新的思路。未来的研究可以进一步优化封装条件，探索更多类型的PNA以及更广泛的靶向基因治疗应用。