可视化短暂的水介导氢键作用，这些氢键有助于酶的近攻击构象的形成

《JACS Au》：Visualize Transient Water-Mediated Hydrogen Bonds Facilitating the Formation of Enzymatic Near-Attack Conformers

水介导氢键动态探测新方法研究：通过超冷却技术结合自旋横向弛豫扰动实验（TRPE），开发了原子级检测瞬时水氢键的策略，成功应用于GB1稳定性和AdK催化机制研究中，揭示了水分子在构象调整和催化中的关键作用，支持近攻击构象理论。

　　水分子介导的氢键在多种大分子活动中起着至关重要的作用，特别是在酶的催化反应过程中。然而，这些氢键的动态特性给其检测带来了挑战。目前，尚缺乏能够直接在原子层面解析蛋白质中与水形成氢键的残基的方法。本文提出了一种结合超冷却技术和基于氮-15横向弛豫扰动的核磁共振（NMR）方法，通过合理调控偶极相互作用和量子相干性，以表征蛋白质中短暂的水分子介导的氢键。该方法经过对不同蛋白质的充分验证后，被应用于研究大肠杆菌腺苷酸激酶（AdK）的催化过程。结合分子动力学（MD）模拟，我们发现Q28与G14之间的水分子介导的氢键有助于酶的近攻击构象（NACs）形成，为理论框架提供了实验支持。这一研究不仅揭示了蛋白质中短暂弱化学键的机制，还为分子动力学模拟与实验验证之间的桥梁提供了新的研究方法。

氢键在生物过程中扮演着不可或缺的角色，如构象转变、分子组装、相互作用以及生物大分子的催化反应。在众多的水-蛋白质相互作用中，识别那些与蛋白质生理功能直接相关的氢键具有重要意义。特别是在酶的活性位点，水分子介导的氢键通常在核亲核攻击过程中发挥关键作用，并在反应中间体的稳定中起到重要作用。因此，准确检测这些氢键有助于深入理解蛋白质的功能机制。然而，传统的实验方法在捕捉NAC构象的多样性以及对这些构象进行精确表征和统计分析方面存在局限。为了弥补这一不足，本文开发了一种新的实验方法，旨在提供更直接的证据来揭示水分子介导的氢键在原子层面的动态特性。

在研究中，我们采用了一种创新的NMR方法，基于氮-15横向弛豫扰动（TRPE），以检测蛋白质中与水形成氢键的弱化学键。该方法通过在NMR脉冲序列中引入特定的形状脉冲，利用偶极-化学位移各向异性（CSA）交叉相关效应以及对极化转移路径的操控，从而对氢键进行扰动分析。这种方法能够在不干扰其他相互作用的情况下，精准地识别蛋白质中与水分子形成的氢键。我们首先在细菌响应调节因子RR468和蛋白G的B1结构域（GB1）上验证了该方法的可行性，结果显示在特定的化学移位频率下，氢键的扰动效应显著增强，从而揭示了该方法在检测弱化学键方面的潜力。

为了进一步验证TRPE方法在水分子介导的氢键检测中的有效性，我们还进行了对GB1的实验。水分子介导的氢键对于GB1的结构稳定性至关重要。通过将GB1溶解在超冷却水环境中，我们观察到了其主链和侧链中与水分子形成氢键的信号变化。在特定温度条件下，水分子的动态行为被显著减缓，使得NMR信号能够更清晰地被捕捉。我们通过分析不同温度下的信号衰减情况，发现水分子介导的氢键在263 K时表现出更强的稳定性。结合分子动力学模拟，我们确认了这些氢键在GB1折叠过程中的重要性，并进一步验证了其对主链不稳定性的潜在影响。

此外，我们还研究了腺苷酸激酶（AdK）中的水分子介导的氢键对催化反应的影响。AdK是一种重要的酶，参与细胞中腺苷磷酸盐的能量代谢过程，催化ATP、ADP和AMP之间的相互转化。在AdK的催化过程中，水分子介导的氢键可能在酶构象变化中发挥关键作用。我们通过设计不同的AdK突变体，并利用NMR技术检测其催化活性的变化，发现Q28突变显著影响了酶的催化效率。结合分子动力学模拟，我们进一步揭示了Q28与G14之间的水分子介导的氢键如何促进近攻击构象的形成，从而提高催化反应的效率。通过分析不同突变体的NAC构象分布，我们发现这些构象在酶催化过程中具有重要作用，支持了NAC理论的实验验证。

为了深入研究水分子介导的氢键在酶催化过程中的作用，我们还采用了多种实验手段，包括NMR谱学、分子动力学模拟以及酶活性检测。在NMR实验中，我们利用不同频率的脉冲序列，对蛋白质中与水分子形成氢键的残基进行了精确的识别。在超冷却水环境中，水分子的动态行为被显著减缓，从而增强了氢键的检测能力。我们通过调整脉冲序列中的参数，对不同残基的横向弛豫速率进行了测量，并发现某些残基在特定条件下表现出显著的信号衰减，表明它们与水分子形成了弱氢键。通过结合分子动力学模拟，我们进一步确认了这些氢键在酶构象调整中的作用，并揭示了它们在催化反应中的重要性。

此外，我们还对AdK的底物和辅因子结合亲和力进行了研究。通过检测不同浓度的底物和辅因子对AdK结构的影响，我们发现Q28突变并未显著降低其对底物和辅因子的结合能力，这表明水分子介导的氢键可能在维持酶活性方面起着重要作用。结合NMR和分子动力学模拟，我们进一步分析了这些氢键如何促进酶的构象调整，并在催化过程中发挥关键作用。通过对比不同突变体的催化活性和结构变化，我们发现水分子介导的氢键对于维持酶的活性构象具有重要意义。

在实验方法方面，我们采用了多种NMR技术，包括1D和2D NMR实验，以精确检测蛋白质中与水分子形成氢键的残基。为了减少其他氢键的干扰，我们对蛋白质进行了均匀氘代处理，并在不同的实验条件下优化了脉冲序列的参数。我们还通过调整脉冲频率和形状，确保对特定氢键的检测精度。在实验过程中，我们采用了不同的温度条件，以模拟不同的水分子动态行为，并通过计算和实验相结合的方式，验证了氢键的形成和稳定性。

为了进一步验证水分子介导的氢键对酶催化反应的影响，我们还进行了酶活性检测实验。通过监测NADH在340 nm处的吸光度变化，我们评估了AdK在不同条件下的催化效率。实验结果显示，Q28突变显著降低了酶的催化速率，这表明水分子介导的氢键在维持酶的催化活性方面具有重要作用。结合分子动力学模拟，我们进一步分析了这些氢键如何影响酶的构象变化，并在催化过程中起到关键作用。

总的来说，本文通过结合超冷却技术和基于氮-15横向弛豫扰动的NMR方法，成功地揭示了蛋白质中水分子介导的氢键的动态特性及其在催化反应中的作用。这一研究不仅为理解酶的催化机制提供了新的实验手段，还为分子动力学模拟与实验验证之间的联系提供了重要支持。未来，这一方法有望被扩展到其他弱相互作用系统的研究中，从而进一步揭示生物大分子中动态弱化学键的关键作用。