可编程环状单链DNA（ssDNA）生产及可扩展DNA折纸组装的简化策略

《JACS Au》：Nick-and-Digest Strategy for Programmable Circular ssDNA Production and Scalable DNA Origami Assembly

DNA origami通过精确自组装复杂纳米结构在药物递送、生物传感等领域有重要应用，但受限于单链DNA（ssDNA）骨架长度。本研究提出Cas9n-T7 Exo酶切策略，通过“ nick-and-digest”法直接从质粒DNA生成7k-nt和15k-nt长环状ssDNA（cssDNA），显著提升折纸尺寸（147×107 nm）和表面积（双倍于传统7kb设计）。优化了退火温度（85℃）、annealing程序（1.5小时）和 staple/scaffold比例（50:1），使折叠效率达27.6%。与两步法（效率13.7%）对比，一锅法具有更高产率（60% vs 30.6%）、更少结构缺陷（AFM证实机械稳定性提升1.73 kcal/mol）及更短反应时间。该策略克服了传统方法序列限制和规模化障碍，为纳米电子、高密度存储和精准医疗平台奠定基础。

　　DNA纳米技术近年来在生物医学、电子工程和材料科学等多个领域展现出巨大的潜力。其核心原理是利用单链DNA（ssDNA）作为骨架，通过互补的“支架”链进行精确折叠，从而构建出具有特定形状和功能的纳米结构。然而，传统的DNA折纸技术受到单链DNA骨架长度的限制，通常只能使用约7000个核苷酸长度的ssDNA，这使得构建更大、更复杂的结构成为挑战。为了解决这一问题，研究人员提出了一种名为“切口与降解”（nick-and-digest）的策略，通过特定的酶促反应，从质粒DNA中直接生成可定制长度的长环状单链DNA（cssDNA）骨架，从而突破了传统技术的局限性。

该方法的核心在于利用Cas9（D10A）nickase（Cas9n）与T7外切酶（T7 Exo）的协同作用。Cas9n是一种经过基因工程改造的Cas9变体，它能够在特定的DNA序列上引入单链切口，而无需依赖固定的限制性酶切位点。通过设计特定的引导RNA（gRNA），研究人员可以精确控制切口的位置，从而实现对ssDNA骨架长度的灵活调控。随后，T7 Exo被用来选择性地降解被切口暴露的单链DNA，最终生成长且高纯度的cssDNA。这种方法的优势在于其高度的序列灵活性，使得研究人员能够根据需求定制不同长度的DNA骨架，而无需依赖特定的基因序列或复杂的合成过程。

为了验证这一策略的有效性，研究人员使用了两种不同长度的质粒DNA：一种是7 kb的M13mp18质粒，另一种是15 kb的慢病毒载体。通过对这些质粒进行Cas9n介导的切口处理，并随后使用T7 Exo进行降解，他们成功地生成了7k-nt和15k-nt的cssDNA骨架。实验结果显示，这种策略不仅能够高效地生产长ssDNA，而且生成的cssDNA在长度和序列上都具有高度的可调性。通过琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜（AFM）的分析，研究人员确认了生成的cssDNA具有较高的纯度和完整性，且其长度可以根据需要进行精确调整。

在构建大型DNA折纸结构方面，这一方法也表现出显著的优势。研究人员利用15k-nt的cssDNA骨架设计并组装了一个尺寸为147×107 nm的矩形DNA折纸结构，其表面积是传统7 kb设计的两倍。为了确保这一结构的成功折叠，他们对三个关键参数进行了系统优化：变性温度、退火程序以及支架与支架链的配比。实验表明，85°C的变性温度能够有效破坏DNA的二级结构，同时避免高温对长链DNA的破坏，从而获得最高的折叠效率（约27.6%）。退火程序的优化也显示出重要性，采用快速退火（约1.5小时）而非长时间的退火（如12小时）可以显著提高折叠效率，同时减少结构缺陷和热损伤。此外，支架链与支架链的比例也对折叠结果产生重要影响，50:1的比例在实验中表现出最佳的折叠效果，而过低或过高的比例则会导致折叠不完全或结构聚集。

为了进一步验证这一方法的优越性，研究人员还对比了单步退火（one-pot）与双步折叠（two-step）两种策略。双步策略通常涉及先将两个较小的DNA结构分别折叠，再通过互补的末端连接成更大的结构。然而，实验结果表明，双步策略在折叠效率、反应时间和结构稳定性方面均不如单步策略。AFM成像和分子动力学模拟（MD）进一步揭示了这一差异：单步策略生成的DNA折纸结构具有更低的平均势能（?15.19 ± 0.014 kBT）和更小的能量波动，表明其结构更加稳定和紧密。相比之下，双步策略的势能较高（?13.46 ± 0.034 kBT），且能量波动更大，这可能与连接处的弱相互作用有关。这些结果表明，单步策略在构建复杂、大型DNA结构时具有更高的效率和更好的机械稳定性。

除了结构性能的优化，这一方法在实际应用中的可扩展性和经济性也值得关注。传统的DNA折纸技术通常依赖于噬菌体（如M13mp18）作为ssDNA来源，这不仅需要复杂的噬菌体培养过程，还受到基因序列的限制。而本研究中使用的“切口与降解”策略则完全基于质粒DNA，这是一种成本低廉且易于获取的材料。通过优化的酶促反应流程，研究人员能够在实验室规模上高效地生产cssDNA骨架，并将其用于构建复杂的纳米结构。此外，这种方法的“全体外”特性避免了对噬菌体或基因工程的依赖，简化了生产流程，提高了实验的可重复性和可操作性。

值得注意的是，该方法不仅适用于DNA折纸结构的构建，还可能在其他领域发挥重要作用。例如，在合成生物学中，长链的cssDNA因其高度的稳定性和低免疫原性，被认为是一种理想的工具。它们可以用于构建细胞外表达系统，或者作为基因编辑的载体，提高CRISPR-Cas9系统的同源重组效率。此外，cssDNA的可编程特性也使其在纳米电子器件、高密度数据存储和先进治疗平台等方面具有广阔的应用前景。研究人员指出，尽管当前使用的Cas9n变体需要特定的PAM序列，但随着新型Cas9变体（如SpG和SpRY）的开发，这一限制将被进一步放宽，从而扩大目标序列的选择范围。

从技术角度来看，这一方法的创新之处在于其高度的可定制性和可操作性。传统的ssDNA生产方法往往受到序列依赖性的限制，而Cas9n的使用使得研究人员能够自由选择切口位置，从而突破了这一瓶颈。此外，T7 Exo的高效降解能力确保了生成的cssDNA具有较高的纯度，为后续的结构折叠提供了良好的基础。通过系统的参数优化，研究人员不仅提高了结构的折叠效率，还有效减少了热损伤和结构缺陷，这在构建大型DNA纳米结构时尤为重要。

在实际应用中，这一方法的可扩展性尤为突出。由于质粒DNA是生物技术中最常见的工具之一，其广泛使用意味着这一策略可以被快速推广和应用。研究人员指出，随着定制化质粒DNA生产技术的成熟，这种“切口与降解”策略有望成为DNA纳米技术领域的标准方法之一。通过将这一方法与现有的DNA设计软件（如caDNAno）相结合，研究人员能够更高效地设计和构建复杂的纳米结构，从而推动DNA纳米技术在更多领域的应用。

综上所述，这项研究不仅为DNA纳米技术的发展提供了新的工具和方法，还为解决传统技术在长度和序列灵活性方面的限制提供了可行的解决方案。通过Cas9n与T7 Exo的协同作用，研究人员成功实现了长链cssDNA的高效生产，并进一步优化了其用于构建大型DNA折纸结构的条件。这种方法的引入，不仅提高了DNA纳米结构的可设计性和可扩展性，还为未来的生物医学、电子工程和材料科学应用打开了新的可能性。随着相关技术的不断完善，DNA纳米技术有望在更多领域实现突破，为科学研究和实际应用带来深远的影响。