多组份免疫细胞分析突显了CD127+ CD8+ T细胞在高分级浆液性卵巢癌患者中的预后价值

《Frontiers in Immunology》：Multi-compartment immune cell profiling highlights the prognostic relevance of CD127+ CD8+ T cells for patients with high-grade serous ovarian cancer

本研究分析了24例高级别浆液性卵巢癌患者的多部位免疫细胞特征，发现外周血中CD127+ CD8+ T细胞比例升高与不良预后相关，为新型预后标志物提供依据。

　　卵巢癌（OC）是一种高度异质性的肿瘤实体，其特征之一是腹腔内积聚腹水，尤其是在晚期肿瘤中尤为明显。免疫细胞浸润通常对OC患者的预后有积极影响，但不同肿瘤相关部位的免疫细胞组成可能对患者的生存率产生不同的作用。因此，我们通过流式细胞术对24名高级别浆液性卵巢癌患者的外周血、腹水和肿瘤组织样本进行了全面分析，并将这些免疫细胞频率与临床参数进行了关联。结果显示，三种样本中免疫细胞浸润水平总体相似，但在晚期OC中CD8+ T细胞比例显著降低。此外，不同免疫细胞亚群在分化状态和表型标志物表达方面存在显著差异。外周血中经典单核细胞、具有细胞毒性潜力的成熟自然杀伤（NK）细胞（CD57+、CD16+、NKG2D+）以及较少分化的T细胞更为常见。相反，在腹水中，树突状细胞（DC）和NKp46+ NK细胞更为普遍。在OC组织中，发现高频率的未成熟中性粒细胞、CD16- NK细胞和效应记忆T细胞，尽管肿瘤内T细胞频率较外周血和腹水样本显著减少。T细胞的表型分析表明，肿瘤样本中存在高水平的激活和抑制性受体表达。特别地，CD127+ CD8+ T细胞在所有三个样本中均表现出显著的正相关性。我们的研究结果提供了证据，表明外周血中CD127+ CD8+ T细胞比例较高，这种记忆T细胞具有较低的颗粒酶B（GrzB）产生能力，是高级别卵巢癌患者不良无进展生存期（PFS）的预后生物标志物，且独立于FIGO III/IV期或手术后残留肿瘤。

卵巢癌作为全球女性中第八大死亡原因，其早期症状缺乏、特异性诊断分子标志物不足以及有效的筛查策略有限，导致该病常在晚期才被发现，从而使得FIGO III-IV期的患者五年生存率低于30%。约75%的卵巢癌为高级别浆液性，这是一种侵袭性强、生长迅速的亚型，起源于卵巢或输卵管上皮，并具有高度转移能力。OC患者的肿瘤微环境（TME）在不同肿瘤相关部位表现出高度异质性。除了局部TME的免疫反应外，外周血中的免疫细胞也会影响抗肿瘤反应和免疫治疗的效果。肿瘤进展过程中，腹腔内积聚的腹水使肿瘤细胞能够在腹腔内扩散并形成转移。然而，腹水中的微环境并不一定与外周血或肿瘤组织中的免疫细胞组成相同，而转移性病灶也可能存在差异。确实，TME中的免疫细胞群体对OC患者的治疗效果和总体生存率（OS）具有决定性作用。然而，癌细胞能够逃避免疫监视，因此，对多个OC相关部位中免疫细胞表型的深入理解有助于寻找可靠的预后生物标志物。

目前，OC研究主要集中在T细胞或其他单一免疫细胞亚群，如NK细胞、髓系来源抑制细胞（MDSC）、单核细胞和树突状细胞（DC），但缺乏对多个免疫细胞亚群在不同OC相关部位的综合分析。因此，我们的研究聚焦于对匹配的外周血、腹水和肿瘤组织样本中的先天和适应性免疫细胞进行表型分析，以提供对OC微环境复杂性的新见解，并为新的预后生物标志物的实施做出贡献。

在材料和方法部分，我们纳入了28名未接受治疗的高级别浆液性OC患者，他们在2019-2024年间接受了初次减瘤手术。所有患者均为G3分级且FIGO III-IV期。在手术前，患者均知情同意，并允许对其获得的样本进行分析。伦理委员会批准了对临床和生物数据的回顾性分析。外周血样本（n=23）通过EDTA含有的单核细胞分离管进行分离。在手术过程中，从腹膜癌灶和卵巢组织中获取的新鲜肿瘤组织（n=24）和腹水（n=21）样本经过特定处理流程。其中至少两名患者的匹配样本来自不同的OC相关部位，构成了本研究的主要队列。此外，从四名满足相同患者标准和免疫细胞表型的OC患者中获取的外周血样本被纳入分析，以扩展患者数量。

为了比较OC患者外周血样本与健康供体（HD）的免疫细胞频率，我们获取了与OC患者性别和年龄相匹配的健康供体的外周血样本。这些样本由德国红十字血库（Dresden，德国）提供，并在供体知情同意的情况下进行处理。所有样本均通过密度梯度离心法进行处理，分离出外周血单个核细胞（PBMCs）并进行后续分析。对于腹水和肿瘤组织样本，我们进行了多次离心处理，以去除大碎片和聚集物，最终得到含有免疫细胞的沉淀物。对于肿瘤组织样本，我们使用了Tumor Dissociation Kit和gentleMACS? Dissociator进行机械和酶处理，以获得可分析的免疫细胞。根据细胞计数，我们使用了不同的细胞数量进行染色和分析，以确保样本质量。

在抗体染色和流式细胞术分析部分，我们对外周血、腹水和肿瘤组织样本中的表面抗原进行了特定染色，并在暗处进行15分钟的4℃孵育。对于细胞内标记物的检测，如FoxP3，我们使用了特定的固定和通透试剂。为了阻断细胞因子的外排，我们同时添加了brefeldin A。在流式细胞术测量前，我们使用了尼龙膜过滤，并添加了7-AAD以区分活细胞和死细胞。数据分析采用FlowLogic?软件，其中包含了对特定门控策略的同型对照分析。所有样本均通过了质量控制，以确保染色和门控策略的准确性。

在统计分析部分，我们使用GraphPad Prism 10.2.3软件对所有数据集进行了统计分析和可视化。点图展示了平均值±标准误（SEM），而多变量Cox比例风险模型包括了风险比（HR）及其95%置信区间（CI）和对应的p值。根据数据集的不同，我们使用了单样本或配对t检验、单向或双向方差分析（ANOVA）配合Bonferroni事后检验，以及Log-rank检验用于Kaplan-Meier生存分析。相关性分析中，我们计算了皮尔逊相关系数和双尾p值，并根据p值的显著性进行了标记（p ≤ 0.05为*，p ≤ 0.01为**，p < 0.001为***）。所有统计检验和显著性水平均在相应图注中进行了说明。

在结果部分，我们对24名OC患者的外周血、腹水和肿瘤组织样本进行了多部位免疫表型分析。总体来看，尽管三种样本的免疫细胞组成相似，但不同亚群的百分比存在显著差异。CD4+ T细胞是三种样本中最常见的免疫细胞类型，其次为CD8+ T细胞、NK细胞、MDSC、浆细胞样树突状细胞（pDC）和常规树突状细胞（cDC）。肿瘤组织中的CD4+ T细胞比例显著低于外周血和腹水样本，而腹水样本中的CD8+ T细胞比例显著高于外周血和肿瘤组织。我们进一步分析了CD14+单核细胞、中性粒细胞和γδT细胞的分布和表型特征。在三种样本中，CD14+单核细胞的频率相近，其中经典单核细胞（CD14+ CD16-）在血液样本中占主导地位，而在腹水中，中间型单核细胞（CD14+ CD16+）和非经典型单核细胞（CD14+ CD16++）的比例增加。此外，PD-L1在所有样本中均表达，但在血液样本中表达比例较低。与健康供体相比，OC患者表现出更高的CD14+单核细胞频率以及更多的PD-L1+单核细胞。

在中性粒细胞分析中，我们发现腹水和肿瘤组织中的中性粒细胞比例相似，但与血液样本相比，腹水和肿瘤组织中的中性粒细胞表现出不同的表型特征。例如，腹水中的中性粒细胞更倾向于成熟状态（CD10- CD16+），而肿瘤组织中的中性粒细胞则更多为未成熟状态（CD10- CD16-）。此外，我们还发现，PD-L1在肿瘤组织中的中性粒细胞中表达比例显著增加。MDSC的分析显示，PMN-MDSC在肿瘤组织中的比例显著高于血液和腹水样本。在OC患者中，PD-L1在MDSC中的表达比例显著高于健康供体，这可能与免疫逃逸机制有关。

NK细胞在三种样本中的比例相近，但其亚群的分布存在差异。血液样本中的NK细胞主要表达NKG2D和CD57，而腹水样本中的NK细胞则更倾向于表达NKp46。CD16在NK细胞中的表达进一步区分了其功能亚群，其中血液样本中的CD16+ NK细胞比例最高，其次是腹水样本，而肿瘤组织中的CD16+ NK细胞比例最低。NK细胞的表达模式在不同样本中存在差异，这可能与不同的微环境和免疫功能有关。

γδT细胞在三种样本中的比例较低，但在肿瘤组织中表现出更高的成熟状态和表达多种激活和抑制性受体。CD4+和CD8+ αβT细胞的分析显示，肿瘤组织中的T细胞分化状态与外周血和腹水样本存在显著差异。CD4+ T细胞在血液样本中以未成熟状态（T_N）为主，而在肿瘤组织中则以中央记忆T细胞（T_CM）和效应记忆T细胞（T_EM）为主。CD8+ T细胞在腹水样本中表现出较高的效应记忆状态，而血液样本中的CD8+ T细胞则以未成熟状态为主。此外，我们发现肿瘤组织中的CD8+ T细胞表达PD-1和LAG-3的比例显著增加，这可能表明其处于功能失调状态。

在分析免疫细胞与临床病理特征及临床结果之间的关系时，我们发现CD127+ CD8+ T细胞的比例在所有三种样本中均表现出显著的正相关性。特别是在血液和肿瘤组织中，CD127+ CD8+ T细胞比例高与不良的无进展生存期（PFS）和总体生存期（OS）相关。这些细胞在血液中的比例超过15%的CD8+ T细胞比例，被认为是独立的预后生物标志物。此外，我们还发现CD127+ CD8+ T细胞在激活后表现出较低的颗粒酶B（GrzB）表达，这可能与其记忆性T细胞特征有关，进而影响其抗肿瘤功能。

在讨论部分，我们进一步探讨了不同免疫细胞亚群在OC微环境中的作用。树突状细胞（DC）在OC微环境中起关键作用，特别是在诱导和调控先天和适应性免疫反应方面。我们的结果显示，pDC和cDC在三种样本中的比例相近，但在腹水样本中比例最高。这可能与腹水中的免疫环境有关，例如，pDC可能通过ICOS-L表达促进T调节性细胞（T_reg）的激活，从而形成免疫抑制微环境。此外，我们的研究还发现，OC患者外周血中的CD14+单核细胞比例显著高于健康供体，这可能与肿瘤相关的免疫逃逸有关。

中性粒细胞在OC患者中的表现也显示出不同的功能状态。腹水样本中的中性粒细胞更倾向于成熟状态，而肿瘤组织中的中性粒细胞则更多为未成熟状态。这些中性粒细胞可能通过形成中性粒细胞胞外陷阱（NETs）促进肿瘤的转移和进展。此外，MDSC在OC患者外周血和腹水中的比例显著增加，这可能与肿瘤的免疫逃逸有关。

NK细胞在OC患者中的表现显示出不同的功能特征。血液样本中的NK细胞以成熟状态为主，而肿瘤组织中的NK细胞则以未成熟状态为主。这可能与不同的微环境和免疫调节机制有关。我们的研究还发现，NK细胞在腹水样本中的表达比例显著高于血液和肿瘤组织，这可能与其在腹水中的抗肿瘤功能有关。

γδT细胞在OC患者中的表现显示出较低的频率，但其在肿瘤组织中的比例较高。这些细胞可能通过多种机制影响肿瘤的免疫反应，例如，表达CD69和PD-L1，这可能表明其处于激活状态并可能抑制其他T细胞的功能。此外，我们的研究还发现，CD127+ CD8+ T细胞在OC患者中的比例较高，并且与不良预后相关，这可能与其较低的颗粒酶B表达和记忆性T细胞特征有关。

在结论部分，我们总结了免疫细胞在OC不同部位中的分布和功能特征。总体来看，免疫细胞的总体比例在三种样本中相近，但其分化状态和表型标志物表达存在显著差异。血液样本中成熟NK细胞和较少分化的T细胞比例较高，而腹水中则以DC和成熟中性粒细胞为主。在肿瘤组织中，未成熟中性粒细胞、CD16- NK细胞和效应记忆T细胞比例较高，尽管肿瘤内的T细胞比例低于其他两种样本。特别是FIGO IV期的患者表现出显著的CD8+ T细胞减少，这可能与免疫逃逸有关。CD127+ CD8+ T细胞的比例在所有三种样本中均表现出显著的正相关性，并且其比例高与不良预后相关。这些细胞在血液中的比例超过15%的CD8+ T细胞比例，被确认为独立的预后生物标志物。通过综合分析，我们进一步明确了这些细胞在OC免疫微环境中的作用，为未来的免疫治疗策略提供了新的思路。