解码阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）中的缺氧-外泌体-免疫三联体机制：通过可解释的机器学习方法揭示PRCP/UCHL1/BTG2驱动的代谢紊乱

《Frontiers in Immunology》：Decoding the hypoxia-exosome-immune triad in OSA: PRCP/UCHL1/BTG2-driven metabolic dysregulation revealed by interpretable machine learning

本研究通过整合转录组数据、机器学习模型（XGBoost）和单样本基因集富集分析（ssGSEA），发现PRCP、UCHL1和BTG2可作为阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）的外泌体相关生物标志物，揭示其通过调节HIF-1α信号通路、免疫细胞浸润（如NK细胞和记忆B细胞）及脂代谢紊乱（如MMP9、APOB）介导OSA的免疫-代谢失调机制，并筛选出Potential Pentaphenate和Delphinidin等靶向治疗药物。

　　### 睡眠呼吸暂停的免疫代谢失衡与外泌体相关生物标志物的探索

睡眠呼吸暂停（Obstructive Sleep Apnea, OSA）是一种常见的睡眠障碍，其特征是夜间呼吸的反复阻塞或部分阻塞，导致血氧饱和度下降、间歇性低氧（Intermittent Hypoxia, IH）以及代谢和免疫系统的紊乱。全球范围内，据估计约有10亿人受到OSA的影响，且其发病率正在逐年上升，主要与全球肥胖率的增加密切相关。OSA不仅影响个体的睡眠质量，还与多种慢性疾病，如心血管疾病、糖尿病、高血压以及免疫相关疾病之间存在复杂的相互作用。然而，目前OSA的诊断主要依赖于多导睡眠监测（Polysomnography, PSG），这种方法虽然准确，但因其成本高昂和操作复杂，难以在早期筛查和长期治疗监测中广泛应用。因此，寻找可靠的生物标志物成为OSA研究的重要方向。

外泌体（Exosomes）作为细胞间通讯的重要媒介，近年来在多种疾病的发病机制中受到广泛关注。外泌体是细胞分泌的一种纳米级囊泡，通常在30至150纳米之间，携带丰富的蛋白质、脂质、RNA等生物分子。这些外泌体能够通过调控信号传递、清除代谢废物以及维持微环境稳态，对免疫和代谢过程产生深远影响。研究发现，外泌体在肥胖相关的代谢异常中起着关键作用，例如，脂肪组织巨噬细胞（Adipose Tissue Macrophages, ATMs）通过外泌体释放miR-155，影响脂肪细胞的代谢功能，从而调节肥胖相关疾病的发生发展。同时，外泌体携带的miR-34a能够抑制M2型巨噬细胞的极化，加剧由肥胖引发的慢性炎症状态。这些发现表明，外泌体在脂肪细胞与免疫细胞之间的双向调控中扮演着重要角色，为理解代谢性疾病提供了新的视角。

基于外泌体在免疫和代谢调控中的关键作用，本研究提出一个创新性假设：间歇性低氧可能改变脂肪组织的外泌体分泌模式，从而影响免疫细胞的浸润状态，最终推动OSA的病理过程。为了验证这一假设，本研究整合了来自两个GEO数据库（GSE135917和GSE38792）的转录组数据，采用生物信息学方法进行分析。通过差异表达分析、功能富集分析以及机器学习建模，我们筛选出与OSA相关的外泌体相关生物标志物，并进一步验证了这些标志物在免疫和代谢失衡中的作用。此外，本研究还通过体外和体内实验，对这些生物标志物的表达变化及其潜在的治疗靶点进行了验证。

### 研究方法与数据整合

本研究采用多组学整合策略，首先从GEO数据库中获取了与OSA相关的转录组数据。GSE135917和GSE38792两个数据集均使用Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array平台进行测序，分别包含8个对照样本和34个OSA样本（来自皮下脂肪组织）以及8个对照样本和10个OSA样本（来自内脏脂肪组织）。通过log变换和批次效应校正，我们标准化了数据，并利用主成分分析（PCA）评估了数据集在批次校正前后的差异，确保了数据的可比性和可靠性。

随后，我们对差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）进行了功能富集分析，使用Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库，识别出与炎症反应、内吞作用以及细胞骨架结构相关的显著富集基因。此外，KEGG分析还揭示了与脂质代谢和动脉粥样硬化相关的通路。这些结果为理解外泌体相关基因在OSA中的作用提供了分子层面的依据。

为了进一步筛选出与OSA最相关的生物标志物，我们采用了LASSO回归和随机森林（Random Forest, RF）分析。LASSO回归通过正则化方法减少了潜在的基因共线性，最终筛选出10个候选基因。而随机森林分析则基于基因的重要性评分（Importance > 4），进一步缩小了候选基因的范围。最终，PRCP、UCHL1和BTG2被确定为与OSA相关的三个关键生物标志物。通过箱线图和相关性分析，我们发现PRCP和UCHL1在OSA组中显著上调，而BTG2则显著下调。这一结果为后续的诊断模型构建和免疫相关分析奠定了基础。

### 诊断模型的构建与评估

为了评估这些生物标志物的诊断价值，我们构建了一个基于多变量逻辑回归的模型，并利用Nomogram（列线图）可视化了该模型的预测能力。Nomogram通过将PRCP、UCHL1和BTG2的表达水平转化为评分系统，从而预测个体发生OSA的风险。此外，我们还采用了XGBoost算法进行机器学习建模，该算法在二分类任务中表现出较高的准确性和鲁棒性。XGBoost模型的AUC值达到了0.968，表明其具有较强的预测能力。为了防止模型过拟合，我们采用了5折交叉验证，并调整了学习率和树的最大深度等超参数，以确保模型的稳定性。

在模型解释方面，我们使用了SHAP（SHapley Additive exPlanations）方法，该方法能够揭示单个基因对模型预测的贡献程度。SHAP总结图显示，PRCP对模型的预测贡献最大，其平均SHAP值为0.334，表明其在OSA发生中的核心作用。而UCHL1和BTG2的贡献相对较小，但其在模型中的作用仍不可忽视。通过依赖图和力图（Force Plot），我们进一步分析了不同基因在预测OSA风险中的非线性关系，发现BTG2的表达水平与预测风险之间存在复杂的调控机制。这些结果不仅展示了这些生物标志物的诊断潜力，也揭示了机器学习在解析复杂生物网络中的价值。

### 免疫相关分析与药物靶点预测

为了深入理解这些生物标志物在免疫系统中的作用，我们采用单样本基因集富集分析（ssGSEA）方法，评估了其与免疫细胞浸润水平之间的关系。分析结果显示，UCHL1和PRCP与CD56bright自然杀伤细胞（Natural Killer Cells）表现出显著的正相关，而与记忆B细胞（Memory B cells）则呈负相关。相反，BTG2表现出相反的关联模式。这一结果表明，这些生物标志物可能通过调控不同的免疫细胞亚群，影响OSA的免疫微环境。此外，我们还通过ssGSEA分析，揭示了这些基因与免疫相关通路之间的联系，进一步支持了它们在免疫调节中的关键作用。

在药物靶点预测方面，我们利用DSigDB数据库，通过分析基因-药物相互作用，识别了可能与这些生物标志物相关的治疗化合物。其中，Pentaphenate和Delphinidin被发现与PRCP和BTG2具有显著的相互作用。这些化合物可能通过调控外泌体相关的信号通路，改善OSA患者的免疫代谢紊乱。通过Cytoscape软件构建的药物-基因相互作用网络图，直观地展示了这些化合物与关键生物标志物之间的潜在联系，为未来的研究提供了新的方向。

### 体外与体内实验验证

为了进一步验证这些生物标志物的表达变化及其在OSA中的作用，我们进行了体外和体内实验。在体外实验中，我们使用了SW872人脂肉瘤细胞和3T3-L1小鼠前脂肪细胞，并在模拟正常氧条件（Normoxia）和间歇性低氧（Intermittent Hypoxia, IH）的环境下培养这些细胞。结果显示，在IH条件下，PRCP和UCHL1的mRNA表达水平显著升高，而BTG2的表达则显著降低。这一结果在多个独立实验组中得到了重复，表明这些基因的表达变化具有高度的可重复性。

在体内实验中，我们采用C57BL/6J小鼠模型，将小鼠随机分为正常氧组和慢性间歇性低氧组，并在4周后收集其脂肪组织进行qRT-PCR和免疫组化（IHC）分析。结果同样显示，PRCP和UCHL1在OSA小鼠模型中显著上调，而BTG2则显著下调。通过免疫组化染色，我们进一步观察到这些基因在组织中的表达水平，发现OSA组中PRCP和UCHL1的阳性染色面积显著增加，而BTG2的阳性染色面积显著减少。这些结果不仅支持了我们在生物信息学分析中发现的基因表达模式，还表明这些生物标志物可能在OSA的发病机制中发挥关键作用。

### 研究发现与意义

本研究首次识别出PRCP、UCHL1和BTG2作为与OSA相关的外泌体相关生物标志物，这些基因在免疫和代谢失衡中具有重要作用。PRCP作为丝氨酸蛋白酶，可能通过调节M1型巨噬细胞的分化和α-MSH的代谢平衡，参与OSA引发的系统性炎症反应。UCHL1则通过调控HIF-1α的核转位和PI3K/AKT信号通路，进一步加剧M1型巨噬细胞的极化，同时抑制自然杀伤细胞的活性。BTG2则主要通过调控STAT3信号通路和与PRMT1形成的蛋白复合物，影响B细胞的分化和成熟，从而维持免疫系统的稳态。

这些发现不仅揭示了OSA的潜在分子机制，还为开发新的诊断和治疗策略提供了理论支持。通过整合转录组数据、机器学习模型、免疫微环境分析以及体外和体内实验验证，我们提出了一个“低氧-外泌体-免疫”调控轴的概念，这一模型能够解释OSA的病理过程。尽管本研究仍存在一定的局限性，例如仅基于脂肪组织的转录组数据，样本量较小，以及DSigDB预测的药物需要进一步实验验证，但其结果仍具有重要的科学价值和临床意义。

### 研究展望与应用前景

随着对OSA机制的深入研究，外泌体相关生物标志物的识别和验证为疾病的早期诊断和个性化治疗提供了新的思路。PRCP、UCHL1和BTG2作为关键的外泌体相关基因，可能成为未来OSA诊断和治疗的重要靶点。此外，本研究提出的“低氧-外泌体-免疫”调控轴为理解OSA的系统性病理机制提供了新的框架，也为其他代谢性疾病的发病机制研究提供了借鉴。

未来的研究可以进一步扩大样本量，结合多种组织类型的数据，以更全面地揭示OSA的病理过程。同时，针对这些生物标志物的药物开发和临床试验也应尽快推进，以评估其在治疗OSA中的潜在应用。此外，外泌体的分离和功能分析可能成为研究OSA免疫代谢失衡的新工具，为精准医学的发展提供新的方向。

综上所述，本研究通过多学科交叉的方法，揭示了外泌体相关生物标志物在OSA免疫代谢失衡中的关键作用，为疾病的诊断和治疗提供了新的理论依据和研究方向。这些发现不仅有助于加深对OSA病理机制的理解，也为未来开发更精准的诊断工具和治疗策略奠定了基础。