一种早期阶段的3D成纤维细胞肿瘤模型能够模拟原始肿瘤微环境的基因表达情况，其中包括与癌症进展和药物耐药性相关的基因

《Frontiers in Oncology》：An early-stage 3D fibroblast-featured tumor model mimics the gene expression of the na?ve tumor microenvironment, including genes involved in cancer progression and drug resistance

肿瘤微环境（TME）中肿瘤细胞与成纤维细胞的相互作用对ECM沉积和药物抵抗至关重要。本研究采用悬浮滴落系统构建B16F10肿瘤细胞与NIH/3T3成纤维细胞的共培养三维球体模型，模拟早期TME。结果显示，共培养球体在结构（更接近实体瘤的“团块”形态）、ECM沉积（检测到VI型胶原）及基因表达（693个基因与体内肿瘤一致，涉及癌症相关通路如“癌症通路”和药物抵抗相关通路）上显著优于单一细胞培养。RNA测序和免疫荧光分析证实，成纤维细胞通过调控mTOR蛋白表达等机制影响肿瘤细胞生物学行为，为建立更精准的体内模拟模型提供了依据。

　　在癌症研究领域，肿瘤微环境（TME）作为癌症发生、发展和转移的关键因素，一直受到广泛关注。肿瘤微环境不仅由癌细胞组成，还包括多种非癌细胞，如成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞、周细胞以及免疫细胞等，它们共同构建了一个复杂的动态系统。这一系统通过直接的细胞间相互作用、可溶性因子的分泌以及细胞外基质（ECM）的动态变化，影响癌细胞的形态、功能、增殖、迁移及对治疗的反应。然而，传统的二维（2D）细胞培养模型在模拟这种复杂微环境方面存在明显局限，难以准确反映真实肿瘤的生物学特征。因此，构建更接近体内环境的三维（3D）模型成为研究癌症生物学机制和开发新药的重要方向。

本研究提出了一种基于悬挂滴落法的新型3D球体模型，该模型通过将小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）与小鼠成纤维细胞（NIH/3T3）共同培养，以模拟早期肿瘤微环境的结构和功能特征。该方法的优势在于其成本较低、便于控制球体大小，并且能够促进细胞间的相互作用，从而形成具有类似体内肿瘤结构的多细胞聚集体。然而，该方法也存在一定的局限性，例如在更换培养基时需要较高的操作技巧，且由于培养基渗透性不足，球体的存活时间通常不超过3周。相比之下，基于支架的3D培养系统提供了更为稳定的结构支持，但其对细胞行为的影响可能因材料的不同而有所差异，需进行优化。此外，水凝胶系统因其高水含量和可调控的机械强度，被认为是最接近体内组织环境的3D培养方式之一，尤其是在模拟天然ECM方面表现出色。

研究结果显示，仅由B16F10细胞形成的球体在第7天时几乎检测不到ECM沉积，而与NIH/3T3成纤维细胞共培养的球体则显示出显著的ECM沉积，尤其是在第7、14和21天时，其组织结构更为紧密和规则，呈现出与体内肿瘤相似的形态学特征。通过荧光显微镜观察，共培养球体中的两种细胞呈现出均匀分布，表明它们之间存在协同作用，而非竞争关系。这种结构的形成不仅依赖于细胞间的直接相互作用，还与成纤维细胞对ECM的合成和沉积能力密切相关。进一步的RNA测序分析表明，B16F10–NIH/3T3共培养球体的基因表达谱与体内肿瘤样本高度相似，共有693个基因在关键通路中表现出一致的表达模式，包括与癌症相关通路（如“癌症通路”）以及与药物耐受性相关的基因。这些基因在癌症进展和治疗抵抗中起着至关重要的作用，表明该3D模型在模拟体内肿瘤生物学特性方面具有较高的可靠性。

在实验过程中，研究人员采用了多种技术手段来验证这些发现。例如，通过免疫荧光（IF）和免疫组化（IHC）分析，检测了共培养球体和体内肿瘤组织中特定蛋白（如mTOR）的表达情况。结果表明，mTOR蛋白在共培养球体和体内肿瘤组织中均能被检测到，而在单一细胞培养系统中则未见明显表达。这一发现进一步支持了3D共培养模型在再现体内肿瘤相关基因表达和蛋白功能方面的有效性。此外，研究还通过图像分析软件（如ImageJ）对球体的形态进行了量化评估，结果显示共培养球体的“圆度”指数显著高于单一细胞培养球体，表明其结构更为紧凑和规则。

从基因表达的角度来看，研究发现3D共培养球体与体内肿瘤样本之间存在高度相似的表达模式，尤其是在与癌症进展和药物耐受性相关的通路中。这些通路包括但不限于“癌症通路”、“细胞周期调控”、“凋亡调控”以及“信号传导通路”等。其中，一些关键基因（如EGLN1、RALBP1、FZD3、PTGER1、BRAF、PRKCA、ADCY7、MTOR、CKS1B、NFKBIA、RASSF1、CDK6、CDK4、GNAQ、TRAF5、MAPK1、EP300、ITGA6、VHL和RAF1）在体内肿瘤和共培养球体中均表现出相似的表达水平，表明这些基因在肿瘤微环境中具有重要的调控作用。值得注意的是，这些基因不仅参与癌细胞的增殖和存活，还与癌细胞对多种治疗手段（如化疗、放疗和靶向治疗）的耐受性密切相关，因此在癌症研究和药物开发中具有重要意义。

通过比较不同培养条件下的基因表达数据，研究人员发现，3D共培养球体与体内肿瘤样本之间的基因表达差异主要体现在某些关键通路中。例如，某些基因在共培养球体中被显著上调，而另一些则被下调，这可能反映了3D模型中细胞间的复杂交互作用以及微环境对基因表达的调控。此外，研究还指出，虽然3D共培养模型在模拟体内肿瘤的某些特征方面表现出色，但其在再现肿瘤异质性和免疫系统相互作用方面仍存在不足。这提示我们，未来的研究可以进一步引入其他细胞类型，如内皮细胞、免疫细胞等，以构建更为复杂的肿瘤微环境模型，从而更全面地模拟肿瘤的生物学行为。

本研究的意义在于，它为癌症研究提供了一种新的3D模型，该模型能够更真实地再现肿瘤微环境的结构和功能特征。相比于传统的2D模型，3D共培养系统能够更有效地模拟癌细胞与微环境之间的相互作用，包括ECM沉积、细胞形态变化以及基因表达模式的调整。这些特征对于理解肿瘤生物学机制、开发更精准的癌症治疗策略具有重要意义。此外，该模型还可以用于药物筛选，减少对动物实验的依赖，从而提高研究效率并降低实验成本。

然而，3D模型仍然面临一些挑战。例如，如何在培养过程中维持球体的长期存活仍然是一个需要解决的问题。由于培养基渗透性不足，球体的核心部分可能无法获得足够的营养和氧气，导致细胞死亡。因此，研究人员在实验设计中采取了多种措施，如控制培养时间、优化细胞比例等，以延长球体的存活时间。此外，球体的结构和功能特性也可能受到细胞来源、培养条件以及材料选择等因素的影响，因此需要进一步优化和标准化实验流程，以确保结果的可重复性和可靠性。

总的来说，本研究通过构建一种基于悬挂滴落法的3D共培养模型，成功模拟了早期肿瘤微环境的结构和功能特征。该模型不仅能够更真实地再现体内肿瘤的基因表达模式，还能够通过ECM沉积和细胞形态变化，为癌症研究提供新的视角和工具。尽管该模型在某些方面仍存在局限性，但它无疑为未来癌症研究和药物开发提供了一个重要的平台。随着技术的不断进步，3D模型有望进一步完善，成为癌症研究中不可或缺的工具。