一种利用衰减全反射-傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱结合化学计量分析和卷积神经网络（CNN）快速区分灵芝属物种的方法

《Frontiers in Chemistry》：A rapid approach for discriminating Ganoderma species using attenuated total reflectance–Fourier transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopy integrated with chemometric analysis and convolutional neural network (CNN)

灵芝属物种鉴定中，采用ATR-FTIR光谱结合正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和卷积神经网络（CNN）的综合方法，成功实现了G. lucidum、G. sinense和G. tsugae的区分。OPLS-DA模型准确率达98.61%，敏感性97.92%，特异性98.96%，RMSEE/RMSEP/RMSECV均小于0.3，验证了其可靠性。CNN模型在数据增强后表现稳定，10次随机分割测试平均准确率89.84%，敏感度84.75%，特异度92.38%，精度0.87±0.02，召回率0.85±0.03，F1值0.86±0.03，变异系数均低于5%。两种方法结合为药用真菌提供了高效非破坏性鉴定方案，未来可扩展至其他草药鉴定。

　　本研究旨在解决灵芝属（*Ganoderma*）物种的掺假和误分类问题。灵芝是一种传统的药用真菌，属于灵芝科，广泛应用于中国及亚洲地区的传统医学中。其历史可追溯至《神农本草经》（约公元前100年），并在众多古籍中被提及。如今，灵芝已能够大规模人工栽培，用于研究和药用目的。尽管已有超过20种灵芝属物种被研究，但其中*Ganoderma lucidum*（红灵芝）是最常被研究的，而*Ganoderma sinense*（紫灵芝）在中国也具有重要地位。自2001年以来，*Ganoderma tsugae*（日本灵芝）已被批准用于健康产品，这三种灵芝属物种也被中国政府列为可用于健康食品的合法原料。

灵芝的健康效益主要归因于其活性成分，如三萜类化合物和多糖。三萜类化合物具有显著的药理作用，包括抗肿瘤、保肝、抗血管生成和抗组胺等；而多糖则有助于增强免疫功能。在实际应用中，灵芝提取物被广泛用作健康食品，如饮料、咖啡粉、补充剂和糖浆等。然而，由于灵芝具有较高的经济价值，市场上出现了对灵芝的掺假行为，影响了灵芝产品的真伪性。这种掺假行为也受到其多样化的功能特性推动，进一步加剧了对灵芝产品安全性的担忧，以及对监管机构和消费者信任的挑战。

为确保灵芝属物种的准确分类，研究者们采用了一系列的鉴别方法，如DNA条形码、高效液相色谱（HPLC）、薄层色谱（TLC）和毛细管电泳。然而，这些方法在本研究中并未被采用，因为它们通常需要复杂的样品预处理和较长的分析时间，这不符合制药行业和监管机构在大规模中药材鉴别的效率需求。因此，研究者们转向了快速、简便且非破坏性的光谱分析方法，如衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）、近红外光谱（NIR）和拉曼光谱。这些光谱方法在样品预处理方面要求较低，能够提供清晰的分子指纹，从而实现对中药材的准确识别。

ATR-FTIR光谱分析是一种快速、非破坏性且成本效益高的技术，可以捕捉样品中的分子振动信息，且样品预处理需求较低。为了解读其复杂的光谱数据，通常采用化学计量学方法，如主成分分析（PCA）、PCA-分类和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），以降低数据维度、识别模式并区分不同组别。近年来，卷积神经网络（CNN）作为一种新兴的深度学习方法，因其能够自动从数据中学习特征，无需人工提取，因此在中药材识别中展现出巨大潜力。虽然化学计量学模型仍然具有强大的分析能力，但CNN在处理大规模和复杂数据时具有更好的扩展性和适应性，使其成为一种有价值的互补工具。

在本研究之前，已有研究利用ATR-FTIR光谱结合化学计量学方法对灵芝属物种进行区分。然而，这些研究并未引入深度学习方法，因此未能充分发挥数据驱动分类的优势。考虑到这些已有研究，本研究在传统方法的基础上进行了拓展，引入了CNN，以进一步提升灵芝属物种的分类能力。在近期的文献中，CNN已被广泛应用于农作物病害识别、植物表型分析和植物物种分类等任务。然而，关于CNN在灵芝属物种分类方面的研究仍较为有限，尤其是在数据量和样本分布方面。因此，本研究尝试将CNN与化学计量学方法结合，以提高灵芝属物种的识别效果。

本研究使用了118个灵芝属样品，这些样品由福建中医药大学提供。样品包括三种不同的灵芝属物种：*G. lucidum*（红芝）、*G. sinense*（紫芝）和*G. tsugae*（日本芝）。其中，红芝有78个样本，紫芝和日本芝各20个样本。这些样品来源于中国，采集后在50℃下烘干8至9小时，随后被研磨成细粉，并通过200目不锈钢筛进行筛选，最后在8℃下储存以备实验使用。在进行ATR-FTIR分析之前，样品会再次在50℃下加热1小时，以确保其处于最佳状态。

ATR-FTIR光谱数据的采集和处理过程是本研究的关键环节。研究使用了一台Spectrum Two?傅里叶变换红外光谱仪（PerkinElmer，美国），并配备了Universal Attenuated Total Reflectance（UATR）附件。为了确保光谱数据的一致性，所有样品都会被放置在UATR晶体表面，以均匀接触。实验环境为温湿度受控的房间，以减少外部因素对光谱测量的影响。采集的光谱数据以36次扫描的方式记录，波长范围为4,000至400 cm?1，分辨率为4 cm?1，间隔为1 cm?1，以提高信噪比和光谱分辨率。数据的分析使用了Spectrum 10.5.3软件（PerkinElmer，美国）。

为了提高ATR-FTIR光谱数据的可解释性，研究进行了ATR校正，对测量的光谱数据进行数学处理，以补偿红外辐射的衰减。此外，对光谱基线进行了校正，并进行了平滑处理以减少噪声。通过将基线校正和光谱平滑后的数据进行算术运算，包括减法处理和归一化，进一步提高了数据的准确性。

在本研究中，采用了多种数据处理和分析方法，包括化学计量学分析和CNN模型。化学计量学分析采用了无监督的PCA方法，以及有监督的PCA-分类和OPLS-DA方法。通过PCA方法，研究者能够观察到不同灵芝属物种之间的光谱差异。PCA-分类和OPLS-DA方法则用于进一步区分和分类。为了评估模型的性能，所有样本被随机分为两组：一组用于校准，另一组用于验证。校准组包含三种灵芝属物种光谱数据的60%，验证组则包含剩余的40%。内部验证通过排列测试（permutation test）进行，共进行了100次排列，以确保模型的可靠性和稳定性。化学计量学分析使用了SIMCA 14.1软件（Umetrics，瑞典）进行处理。通过计算准确率、灵敏度和特异性等指标，评估了模型的性能。

在CNN模型的构建过程中，研究者面临的一个主要挑战是样本数量不足。尽管总共有118个样本，但样本分布不均，尤其是紫芝和日本芝的样本数量较少，导致模型训练过程中可能产生类别不平衡的问题。类别不平衡可能导致模型对少数类别的识别能力较差，从而影响整体的分类效果。因此，研究引入了数据增强技术，特别是合成少数过采样技术（SMOTE），以解决样本分布不均的问题。SMOTE通过比较少数类别的样本与邻近样本，生成新的合成样本，从而提高模型的泛化能力。

在数据增强过程中，原始数据集被分为两组，分别用于训练和测试。每组中，每个类别的样本数量尽可能相等，以确保数据的平衡性。随后，SMOTE被应用于每组数据，以生成更多的样本，最终将样本数量提升至500个。通过数据增强，研究者成功地改善了样本分布，为CNN模型的训练提供了更均衡的数据支持。

在CNN模型的训练和测试阶段，研究者采用了10折交叉验证方法，以优化超参数并提高模型的泛化能力。在训练过程中，通过绘制学习曲线，研究者可以观察到模型的训练损失和验证损失的变化趋势。学习曲线的绘制有助于识别模型是否出现过拟合或欠拟合问题。在本研究中，学习曲线显示训练损失和验证损失在多个训练阶段逐渐收敛，并在接近相同值时趋于稳定，表明模型能够准确预测样品，而不会出现过拟合现象。

为了评估CNN模型的鲁棒性，研究进行了随机分割测试。随机分割测试通过多次重复实验，观察模型在不同数据分割下的准确率、灵敏度和特异性波动情况。一个稳健且可靠的CNN模型应当在多次随机分割测试中表现出一致和稳定的性能，而不会出现较大的统计波动。研究结果显示，在未进行数据增强的原始数据集中，紫芝和日本芝的准确率、灵敏度和特异性波动较大，而在进行数据增强后的样本中，这些波动显著减小。这进一步验证了数据增强在提升CNN模型鲁棒性方面的重要性。

此外，研究者还通过多类混淆矩阵评估了CNN模型在随机分割测试中的性能。多类混淆矩阵能够提供关于模型分类准确性的详细信息，包括正确预测和误分类的情况。从混淆矩阵的行中可以获取预测值，从列中可以获取真实值。通过分析10次随机分割测试的混淆矩阵，研究者发现红芝的分类效果优于紫芝和日本芝，同时大多数误分类的红芝样本属于日本芝，而大多数误分类的紫芝和日本芝样本则属于红芝。这表明在数据增强之前，样本分布不均严重影响了模型的分类性能。

从整体结果来看，CNN模型在10次随机分割测试中的准确率为89.84% ± 1.96%，灵敏率为84.75% ± 2.95%，特异率为92.38% ± 1.47%。此外，模型的精确率为0.87 ± 0.02，召回率为0.85 ± 0.03，F1得分为0.86 ± 0.03。F1得分是精确率和召回率的调和平均值，数值越接近1，表示模型在分类任务中的表现越好。同时，模型的性能指标在10次随机分割测试中的变异系数（CV）较低，表明其在不同测试中的表现具有较高的稳定性。虽然CNN模型在准确率、灵敏率和特异性方面略逊于化学计量学方法，但其在处理大规模和复杂数据时展现出更好的扩展性和适应性。

化学计量学方法和CNN方法各有优劣。化学计量学方法在数据可解释性方面具有优势，能够提供清晰的模式识别和数据关系分析。相比之下，CNN方法由于其复杂的内部机制，输出结果较为难以理解。化学计量学方法通常适用于小规模和结构相对简单的数据集，但在处理大规模、非线性和复杂数据时可能面临一定的局限性。CNN方法则适用于高维和复杂的数据结构，其分层架构能够在训练过程中自动提取关键特征，从而构建一个稳健的模型。此外，CNN方法的引入为模型提供了自动化特征提取的能力，减少了对光谱预处理的依赖。虽然CNN模型在分类性能上略逊于化学计量学方法，但其在扩展性和适应性方面的优势表明，CNN可以作为识别灵芝属物种的重要工具。

本研究的最终结论是，结合化学计量学分析和CNN模型的方法在灵芝属物种的分类中具有显著优势。化学计量学方法能够提供清晰的模式识别和分类效果，而CNN方法则能够处理大规模和复杂数据，提高模型的泛化能力。这种结合不仅提升了灵芝属物种分类的准确性，还为中药材的鉴定提供了新的思路。未来，该方法有望应用于其他中药材的鉴别，为中药材的标准化和质量控制提供技术支持。此外，研究者计划开发一个公开的鉴定平台，以支持研究、产业和监管应用。尽管本研究已经验证了该方法的可行性，但为了进一步提升其在中药材鉴别的效果，仍需在其他中药材的分类中进行验证和优化。