针对HER2的双靶向纳米体结合剂在耐药肿瘤细胞中与曲妥珠单抗具有协同作用

《Frontiers in Immunology》：Biparatopic HER2-targeted nanobody binder synergizes with trastuzumab in resistant tumor cells

本研究开发了一种双聚体纳米抗体A9F5-H2F5-Fc（AH），靶向HER2的ECD I和ECD II，通过结构建模证实其以trans结合模式促进多价受体聚类，显著增强抗肿瘤活性，尤其在曲妥珠单抗耐药模型中表现出协同增效作用。

　　HER2（人类表皮生长因子受体2）是多种实体瘤中的关键致癌驱动因子。尽管针对HER2的靶向治疗，如曲妥珠单抗（trastuzumab）和帕妥珠单抗（pertuzumab），在临床中展现出显著的疗效，但治疗耐药性仍然是一个重大挑战，这促使了新一代抗HER2药物的研发。在本研究中，我们设计了一种基于双靶点纳米抗体（nanobody）的结合分子，A9F5-H2F5-Fc（简称AH），该分子同时靶向HER2的ECD I和ECD II区域。在HER2表达的肿瘤细胞中，AH表现出更高的受体饱和度、内化和降解能力，相较于曲妥珠单抗和帕妥珠抗的联合使用，其效果更为显著。特别地，在曲妥珠单抗耐药的癌细胞中，AH与曲妥珠单抗联合使用时显示出更优的协同抗肿瘤效果，超过了曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的组合。结构建模预测了AH采用一种跨膜（trans）结合模式，能够促进HER2的多价聚集体形成，这种作用机制是AH独特性的体现。这些发现表明AH是一种经过合理设计的双靶点结合分子，具有克服曲妥珠单抗耐药性的潜力，并强调了基于纳米抗体的双靶点策略在增强HER2阳性癌症抗肿瘤效果方面的前景。

HER2是表皮生长因子受体（EGFR/HER）家族的一员，是一种跨膜的酪氨酸激酶受体，其在大约20-30%的乳腺癌和胃癌中过度表达，同时也在其他一些实体瘤中出现。HER2的扩增驱动了多种致癌信号通路，促进肿瘤进展，诱导治疗耐药性，并与不良临床结果相关。与其他EGFR家族成员不同，HER2作为孤儿受体，缺乏已知配体，其激活主要依赖于与同源受体的异源二聚化。在过去三十年中，HER2靶向治疗彻底改变了HER2阳性实体瘤的治疗格局。开发了一系列HER2定向药物，包括小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）、单克隆抗体（mAbs）和抗体药物偶联物（ADCs），这些药物已被批准用于临床治疗。

曲妥珠单抗是首个获批用于靶向HER2的ECD IV区域的单克隆抗体，其抗肿瘤作用通过抑制HER2-HER3的配体无关二聚化、诱导细胞周期停滞和介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）来实现。尽管在HER2阳性乳腺癌中改善了临床结果，许多患者最终仍会发展为耐药并经历疾病复发。帕妥珠单抗则是一种靶向HER2-ECD II区域的单克隆抗体，旨在阻止配体依赖的HER2异源二聚化。利用其互补的作用机制，帕妥珠单抗与曲妥珠单抗联合使用与化疗相比，在转移性、辅助性和新辅助治疗中显示出更优的抗肿瘤效果，从而获得了FDA对帕妥珠单抗作为协同治疗的批准。然而，这种双抗体策略在乳腺癌中的临床成功并未推广到其他HER2阳性肿瘤中。在HER2阳性转移性胃癌或胃食管交界癌中，帕妥珠单抗的添加未能显著改善曲妥珠单抗联合化疗的整体生存率。此外，HER2靶向治疗的固有和获得性耐药仍然是临床治疗中的主要障碍，凸显了开发新一代HER2靶向药物的必要性。

耐药机制包括受体下调、HER2与其他EGFR家族成员的异源二聚化、下游信号通路的补偿性激活以及HER2的结构改变。双特异性抗体（bsAbs）设计为靶向两个表位或抗原，具有多种作用机制，这些机制是传统单特异性抗体所无法实现的，使其成为克服耐药性的有前景候选药物。例如，zenocutuzumab是一种针对HER2和HER3的双特异性抗体，能够强力抑制heregulin（HRG）驱动的HER2-HER3异源二聚化，并已获得FDA对携带NRG1融合的非小细胞肺癌（NSCLC）或胰腺腺癌患者的加速批准。作为双靶点抗体（bpAbs）的一种亚型，双靶点抗体能够结合同一靶标上的非重叠表位，并具有独特的作用机制。一些HER2定向的双靶点抗体，如zanidatamab和anbenitamab，在临床前和早期临床研究中显示出令人鼓舞的疗效。目前处于临床开发阶段的HER2靶向双靶点抗体主要源自曲妥珠单抗和帕妥珠单抗，因此依赖于ECD II和ECD IV区域的表位。然而，HER2-ECD中的致癌突变，特别是ECD II中的S310F突变，可能会损害帕妥珠单抗的结合能力，从而削弱其治疗效果。因此，依赖帕妥珠单抗表位的双靶点抗体在携带此类突变的患者中可能临床效用有限。最近的研究表明，靶向ECD I或ECD III可能与现有HER2靶向治疗产生协同效应。我们之前开发了一种靶向ECD I的纳米抗体-Fc融合蛋白，其在曲妥珠单抗耐药模型中显示出显著增强的协同抗肿瘤效果。这些发现突显了靶向替代HER2表位以克服耐药性的潜力。

纳米抗体，或称单变量重链结构域（VHH），是最小的天然抗原结合片段，具有高溶解性、稳定性和低免疫原性。与IgG抗体不同，纳米抗体可以在没有轻链的情况下识别抗原。其单体结构使其成为构建双特异性抗体的理想支架，因为它可以避免链错配和不必要的自聚集。在这里，我们报告了一种基于双靶点纳米抗体的结合分子AH的生成，该分子由两个HER2特异性纳米抗体串联连接至IgG Fc区域。这种四价结合分子靶向HER2的ECD I和ECD II区域，实现高结合饱和度，并促进HER2的内化和降解。此外，AH在耐药肿瘤模型中表现出显著增强的与曲妥珠单抗的协同抗肿瘤效果。

为了构建双靶点结合分子，我们克隆了编码HER2特异性纳米抗体的序列到pSCSTa表达载体中，并在Expi293细胞中进行表达。我们通过将纳米抗体连接到Fc域的N端或C端来构建不同的结合分子格式。通过筛选，我们选择了A9F5-H2F5-Fc作为AH进行进一步研究。AH表现出高纯度和良好的分子均一性，其结合能力不受HER2-ECD区域替换的影响，显示出低EC50值（≤1 nM），表明其能够同时结合HER2的ECD I和ECD II区域。这些特性使AH能够在HER2阳性肿瘤模型中实现有效的受体下调和生长抑制。

为了评估AH的结合特性，我们使用流式细胞术和共聚焦显微镜分析了其在HER2阳性肿瘤细胞中的细胞表面结合和内化情况。在NCI-N87细胞中，AH单独使用或与曲妥珠单抗联合使用均诱导了HER2的显著内化，其内化水平超过曲妥珠单抗、帕妥珠单抗及其联合使用。AH的内化效果在不同HER2表达水平的细胞中表现不同，表明其内化能力与HER2表达水平相关。此外，AH与曲妥珠单抗的联合使用进一步增强了内化效果，特别是在配体驱动的耐药模型中。这些结果支持了AH与曲妥珠单抗在HER2阳性癌症模型中具有功能性协同作用。

为了探讨AH的作用机制，我们使用AlphaFold 3对纳米抗体与HER2-ECD的复合物进行了结构建模。建模结果显示，A9F5主要结合ECD I和ECD II，而H2F5则结合ECD II的特定区域。通过分析界面残基，我们发现A9F5与ECD I和ECD II形成多个氢键接触，而H2F5则与ECD II形成两个氢键接触。尽管两者都与ECD II中的K228残基相互作用，但它们的结合表面在空间上是不同的，表明两者结合的表位重叠程度较低。这一结构特征支持了AH通过跨膜结合模式促进HER2的多价聚集体形成。此外，结构建模还显示，AH的双靶点设计使其能够同时结合相邻的HER2分子，从而在细胞表面形成高密度的受体聚集，这可能有助于增强其抗肿瘤效果。

纳米抗体的亲和力并不总是与双靶点抗体的疗效成正比。尽管A9B5（KD=7.8 nM）和A9F5（KD=19.4 nM）是同一母体纳米抗体的亲和力成熟变体，但A9F5-H2F5-Fc（AH）表现出比A9B5-H2F5-Fc更高的抗肿瘤效果。这可能是因为A9F5的中等亲和力有助于其跨膜结合相邻的HER2分子，从而促进受体聚集和更有效的信号阻断。AH的治疗效果不仅依赖于其对HER2的结合能力，还与其促进受体内化和降解的特性密切相关。这些观察结果表明，双靶点结合分子的结构配置、表位位置和动态结合动力学共同决定了其功能表现。

尽管AH在体外显示出良好的抗肿瘤效果，但本研究仍存在一些局限性。首先，虽然AH在体外表现出增强的内化和抗肿瘤活性，但需要在患者来源的异种移植（PDX）或更贴近HER2表达异质性的转基因模型中进行体内验证。其次，与已处于临床阶段的双靶点抗体，如anbenitamab或zanidatamab进行头对头比较尚未开展，这种比较对于评估其疗效、Fc介导的免疫效应功能和药代动力学特性至关重要。第三，纳米抗体格式的长期安全性和潜在免疫原性仍需在非人灵长类动物中进一步评估。最后，预测的纳米抗体-HER2相互作用基于AlphaFold的结构模型，虽然AlphaFold的预测接近实验准确性，但需要通过冷冻电镜或X射线晶体学进行验证，并结合后续的生物实验以获得更确切的结构信息。

综上所述，双靶点纳米抗体结合分子AH结合了结构的简单性和功能的强大性，利用纳米抗体工程和双靶点靶向策略来应对HER2阳性癌症中的关键耐药机制。AH能够促进HER2的显著内化和降解，同时其模块化VHH-Fc格式支持良好的制造性能。在体外模型中，AH显示出与曲妥珠单抗的协同抗肿瘤效果，表明其在当前HER2靶向治疗难以奏效的肿瘤中具有潜在的应用价值。未来的研究需要进一步确定其体内抗肿瘤效果、药代动力学特性和免疫原性，并评估其在HER2靶向治疗策略不断发展的背景下转化应用的潜力。