双功能MgSrCeAl-LDH纳米片通过清除ROS和促进血管生成治疗心肌缺血再灌注损伤

《Journal of Nanobiotechnology》：Dual-function MgSrCeAl-LDH nanosheets enable both ROS clearance and enhanced angiogenesis for myocardial ischemia/reperfusion injury therapy

本研究针对心肌缺血再灌注(I/R)损伤治疗难题，开发了新型MgSrCeAl-LDH纳米片。该材料不仅能高效清除·OH和·O2-（清除效率分别为CeO2的1.78倍和1.61倍），还能在酸性微环境中释放促血管生成的Sr2+。实验表明，MgSrCeAl-LDH使I/R心肌ROS水平降至66.2%，血管密度提高3.6倍，梗死面积减少60.9%。其作用机制与激活PI3K/Akt通路、抑制TGF-β通路相关，为心肌I/R损伤治疗提供了新策略。

　　

当心脏病发作时，及时恢复血液供应是抢救生命的关键，但讽刺的是，血液重新流入缺血组织的过程本身也会造成额外损伤，这就是心肌缺血再灌注损伤。这种损伤已成为心血管疾病治疗领域的重大挑战，目前尚缺乏特异性治疗药物。其核心机制在于再灌注过程中产生的大量活性氧(ROS)，如超氧阴离子(·O₂^-)、过氧化氢(H₂O₂)和羟基自由基(·OH)，它们会对心肌细胞造成不可逆的氧化损伤，并导致持续的心肌纤维化。

与此同时，缺血心肌区域的血管新生和血流重建对于输送氧气和营养物质、抵抗细胞死亡、恢复心脏功能至关重要。然而，现有的治疗策略往往只能单一地解决氧化应激或促进血管生成，无法同时应对急性期的ROS爆发和亚急性期的血管再生需求。更令人困扰的是，目前报道的铈基纳米材料虽然具有一定的ROS清除能力，但对·OH的清除效率较低，且在缺血酸性环境下可能诱发类芬顿反应，产生更多·OH而加重氧化损伤。

针对这一治疗困境，Shen等人创新性地提出了一种多功能纳米治疗平台——镁锶铈铝层状双氢氧化物(MgSrCeAl-LDH)纳米片。这种材料巧妙地将高效的ROS清除能力与促进血管生成功能集成于一体，实现了对心肌I/R损伤的多阶段协同治疗。

研究人员采用简单的"自下而上"方法成功合成了MgSrCeAl-LDH纳米片，并通过透射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)证实其具有约100纳米横向尺寸和约5纳米厚度的片状结构。元素分布分析显示Mg、Sr、Ce、Al元素均匀分布在纳米片整体结构中。X射线光电子能谱(XPS)分析证实了材料中存在Ce³⁺/Ce⁴⁺氧化还原电对和氧空位(OV)，这些特性为其优异的ROS清除能力奠定了基础。

在关键技术方法方面，本研究主要采用了纳米材料合成与表征技术（包括TEM、AFM、XRD、XPS）、ROS清除性能评价体系（ESR光谱、MB/TMB/DHE荧光探针法）、细胞水平的功能验证（CCK-8法、DCFH-DA染色、Calcein-AM/PI染色、JC-1染色、细胞迁移和管形成实验），以及大鼠心肌I/R损伤模型构建和体内治疗效果评估（包括 echocardiography、EB-TTC染色、组织化学染色和免疫组化分析）。此外，还通过转录组测序和生物信息学分析揭示了相关的分子机制。

ROS清除性能介导的MgSrCeAl-LDH

研究人员系统评估了Mg₂Sr_0.2Ce_xAl_0.8-x-LDH的ROS清除能力。通过亚甲基蓝(MB)实验发现，随着Ce掺杂量的增加，材料对·OH的清除性能显著增强，其中Mg₂Sr_0.2Ce_0.75Al_0.05-LDH的表现最优，其·OH清除效率达到CeO₂的1.78倍。3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)实验和电子自旋共振(ESR)光谱进一步证实了该材料出色的·OH清除特性。

对于·O₂^-的清除能力，研究人员使用二氢乙啶(DHE)荧光探针进行评估。结果显示，Mg₂Sr_0.2Ce_0.75Al_0.05-LDH处理组的荧光强度显著减弱，其·O₂^-清除效率达到57.11%，为CeO₂的1.61倍。ESR分析使用DMPO作为捕获剂，同样证实了该材料对·O₂^-的有效清除作用。

特别值得注意的是，MgSrCeAl-LDH在酸性环境(pH 5.0)下能快速释放Sr²⁺，3周内释放浓度达到32.65 ppm，而在中性环境(pH 7.4)下释放较慢(5.13 ppm)。这种酸响应性释放特性与I/R损伤区域的酸性微环境高度匹配，有利于在缺血区域特异性释放促血管生成因子。

表面修饰

为提高材料的生物相容性和稳定性，研究人员用牛血清白蛋白(BSA)对MgSrCeAl-LDH进行表面修饰。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)显示修饰后的材料同时具有LDH和BSA的特征峰，动态光散射(DLS)分析表明MgSrCeAl-LDH-BSA的zeta电位从25.6±1.12 eV显著降低至4.9±1.98 eV，证实了BS的成功修饰。该材料在不同介质中保持7天以上的良好胶体稳定性。

MgSrCeAl-LDH-BSA的体外生物相容性评价

细胞计数试剂盒-8(CCK-8)实验表明，与10-60μg mL^-1浓度的MgSrCeAl-LDH-BSA共孵育24小时后，H9C2细胞和小鼠心脏微血管内皮细胞(MCMECs)的存活率均保持在95%以上。溶血实验显示，在40-200μg mL^-1浓度范围内，溶血率均低于国际标准(5%)，证明该材料具有良好的血液相容性。

细胞摄取和体外最佳浓度

通过共聚焦显微镜观察发现，罗丹明B(RB)标记的MgSrCeAl-LDH-BSA在共孵育8小时后在H9C2细胞和MCMECs中的荧光强度达到最大，表明材料能被有效内化。通过氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型模拟心肌I/R损伤，确定OGD 24小时/R 24小时为最佳建模条件，此时细胞存活率约为63-67%。浓度筛选实验表明，10μg mL^-1的MgSrCeAl-LDH-BSA能使H9C2细胞和MCMECs的存活率分别提高至89.8%和88.1%，因此被选为后续实验的最佳浓度。

MgSrCeAl-LDH-BSA的体外ROS清除、血管生成和细胞保护作用

DCFH-DA染色显示，OGD/R刺激后细胞内ROS水平显著升高，而MgSrCeAl-LDH-BSA处理能有效降低两种细胞中的ROS水平。细胞迁移和管形成实验表明，MgSrCeAl-LDH-BSA处理能显著促进MCMECs的伤口愈合能力，增加管状结构的数量和总长度。Western blot分析进一步显示，MgSrCeAl-LDH-BSA处理能显著上调血管生成相关蛋白Ang1和VEGFb的表达水平。

在细胞保护作用方面，Western blot分析显示MgSrCeAl-LDH-BSA处理能显著降低促凋亡蛋白Faslg和Bax的表达水平。Calcein-AM/PI染色表明，MgSrCeAl-LDH-BSA处理能减少细胞凋亡率。JC-1荧光染色显示，MgSrCeAl-LDH-BSA处理能显著增强线粒体膜电位，表明其对线粒体功能具有保护作用。

体内生物相容性、药代动力学和生物分布评价

大鼠心肌内注射MgSrCeAl-LDH-BSA后14天，主要器官组织学形态无显著异常，肝肾功能指标均在正常范围内。长期安全性评估显示，注射MgSrCeAl-LDH-BSA后14天和28天，血液学参数仍保持在参考范围内。药代动力学研究表明，MgSrCeAl-LDH-BSA的血浆半衰期为27.5小时，且能在心脏组织中持久蓄积，有利于缺血心肌的修复。代谢实验证实该材料可通过尿液和粪便途径排出体外。

MgSrCeAl-LDH-BSA介导的心肌I/R损伤体内治疗效果

通过结扎左前降支冠状动脉(LAD)0.5小时构建大鼠心肌I/R损伤模型。DHE染色显示，MgSrCeAl-LDH-BSA处理能显著降低梗死周边区的ROS水平。TUNEL染色和免疫组化分析表明，MgSrCeAl-LDH-BSA处理能显著减少心肌细胞凋亡和C-caspase3蛋白表达。

伊文思蓝(EB)和2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)双染色显示，MgSrCeAl-LDH-BSA处理组的梗死面积/左心室面积(INF/LV)比值(12.5%)显著低于MIRI组(31.1%)和MIRI+PBS组(32.7%)，表明MgSrCeAl-LDH-BSA能有效减轻心肌梗死。

MgSrCeAl-LDH-BSA治疗后心功能、血管生成和纤维化的评估

超声心动图评估显示，在I/R后第14天，MgSrCeAl-LDH-BSA处理组的左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)和左心室每搏输出量(LVSV)显著改善，而左心室收缩末期内径(LVIDs)和左心室收缩末期容积(LVESV)显著减小，表明心脏功能明显恢复。

CD31免疫荧光染色显示，MgSrCeAl-LDH-BSA处理能显著增加梗死周边区的CD31阳性细胞数量，表明其促进血管生成的作用。Masson三色染色显示，MgSrCeAl-LDH-BSA处理能显著减轻心肌纤维化，同时降低纤维化相关蛋白TGF-β2的表达水平。

MgSrCeAl-LDH-BSA治疗心肌I/R损伤的生物学机制

转录组测序和聚类分析揭示了Control、OGD/R和OGD/R+LDH三组之间基因表达的显著差异。KEGG富集分析表明，MgSrCeAl-LDH-BSA主要影响与凋亡、炎症和纤维化相关的信号通路，其中PI3K-Akt信号通路和TGF-β信号通路最为突出。

Western blot分析证实，MgSrCeAl-LDH-BSA处理能显著增强p-PI3K和p-Akt的磷酸化水平。免疫荧光共定位分析显示，MgSrCeAl-LDH-BSA处理能增强p-PI3K在心肌细胞内的信号。基因集富集分析(GSEA)表明，MgSrCeAl-LDH-BSA能激活血管生成通路，同时抑制TGF-β信号通路。Western blot分析进一步显示，MgSrCeAl-LDH-BSA处理能显著降低TGF-β2和Smad9的蛋白表达水平。

本研究成功开发了一种新型多模态MgSrCeAl-LDH-BSA纳米片，该材料兼具ROS清除和血管生成促进功能，能有效治疗心肌I/R损伤。与CeO₂相比，MgSrCeAl-LDH-BSA纳米片表现出更优异的·OH和·O₂^-清除能力，这归因于Ce³⁺/Ce⁴⁺之间的快速电子转移。更重要的是，该材料能响应缺血酸性微环境释放促血管生成的Sr²⁺，实现对I/R损伤病理级联的多阶段干预。

体外和体内研究一致表明，MgSrCeAl-LDH-BSA不仅具有良好的生物相容性，还能在心肌I/R损伤干预过程中调节氧化应激、促进血管生成、改善细胞凋亡状态和减轻纤维化。生物学机制分析进一步揭示，MgSrCeAl-LDH-BSA通过激活PI3K/Akt信号通路和抑制TGF-β信号通路，减轻心肌梗死和纤维化，从而改善心脏功能。

这项研究通过协同耦合急性期抗氧化防御和亚急性期新生血管机制，为心肌I/R损伤的治疗提供了新策略，具有重要的临床转化潜力。该成果发表于《Journal of Nanobiotechnology》，为缺血性心脏病的临床治疗开辟了新途径。