通过微滴玻璃化法实现树莓茎尖中悬钩子属病毒的成功冷冻保存：病毒活性、定位及解冻后传播能力评估

《Plant Methods》：Cryopreservation of Rubus viruses in raspberry shoot tips via droplet-vitrification: assessment of viral preservation, localization, and post-thaw transmission capacity

本研究针对树莓病毒难以长期保持生物活性的难题，创新性地采用茎尖微滴玻璃化冷冻保存技术，成功实现了RBDV、BRNV和RYNV三种重要悬钩子属病毒的长期保存。通过原位杂交技术明确了病毒在茎尖分生组织中的分布规律，并利用微嫁接和蚜虫传播实验证实了解冻后病毒仍具备完整的侵染性。该研究为植物病毒资源保藏、抗病育种及病毒学研究提供了可靠的技术平台和重要的理论依据。

　　

树莓作为一种重要的经济作物，在全球范围内广泛种植，但其生产过程中常受到病毒病的严重威胁。与真菌和细菌病害不同，病毒病害一旦侵染植株，很难通过化学方法进行有效控制。特别是复合侵染情况，如树莓花叶病和树莓碎果复合症，通常由多种病毒共同作用导致，造成严重的产量损失和经济损失。目前，对树莓病毒的研究和防控面临着病毒保存的重大挑战。由于植物病毒是专性寄生物，必须依赖活体宿主才能存活，传统的病毒保存方法，如低温保存纯化病毒颗粒或冻干处理，往往难以长期维持病毒的生物活性和侵染能力。特别是对于那些不能通过机械传播的树莓病毒，传统方法更是无能为力。因此，开发能够长期保持病毒生物活性的保存技术，对于树莓病毒研究、抗病育种以及病毒检测技术的发展都具有重要意义。

在这项发表于《Plant Methods》的研究中，马晓燕等人探索了一种创新的解决方案——通过茎尖冷冻保存技术来实现树莓病毒的长期保存。该研究选择了三种 economically important 的悬钩子属病毒：树莓丛矮病毒(Raspberry bushy dwarf virus, RBDV)、黑树莓坏死病毒(Black raspberry necrosis virus, BRNV)和悬钩黄网病毒(Rubus yellow net virus, RYNV)作为研究对象，通过在四个树莓品种中进行茎尖冷冻保存实验，系统评估了该技术对病毒保存的效果。

研究人员主要采用了几个关键技术方法：首先利用微滴玻璃化法(Droplet-vitrification)对病毒感染的茎尖进行冷冻保存；通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测病毒存在状态；运用原位杂交技术(In situ hybridization, ISH)精确定位病毒在茎尖组织中的分布；采用微嫁接(Micrografting)方法验证病毒活性；最后通过蚜虫传播实验(Aphid transmission)评估病毒解冻后的生物学功能。实验材料包括来自挪威生物经济研究所和中国西北农林大学的四个树莓栽培种病毒感染的离体植株。

病毒检测与定位分析

通过RT-PCR检测，研究人员首先明确了各树莓品种的病毒感染状态。'Zlatá Kralovna'(ZK)品种同时感染了RBDV、BRNV和RYNV三种病毒，而'Tulameen'(TUM)品种感染了RBDV和BRNV，'Fairview'(FV)和'Stiora'品种则只感染RYNV。病毒定位研究结果显示，RBDV和RYNV在茎尖组织中分布广泛，能够感染包括顶端分生组织(Apical dome, AD)和最年轻的叶原基(Leaf primordia, LPs)在内的各类分生组织。相比之下，BRNV的分布范围较为有限，主要存在于较老的叶原基中，在最年轻的叶原基和顶端分生组织中未检测到病毒信号。值得注意的是，病毒分布模式不仅在不同病毒种类间存在差异，在不同树莓品种中也表现出基因型特异性。

茎尖大小对冷冻保存效果的影响

研究人员比较了不同大小茎尖(0.5毫米、1毫米和2毫米)对冷冻保存后茎尖存活率、再生率以及病毒保存率的影响。实验结果表明，1毫米大小的茎尖在'ZK'和'TUM'两个品种中都获得了最高的存活率(分别为90%和94%)和再生率(分别为90%和87%)。病毒保存率也显示出相同趋势，1毫米茎尖对RBDV、BRNV和RYNV的保存效率最高，在'ZK'品种中分别达到83%、66%和83%，在'TUM'品种中RBDV和BRNV的保存率分别为87%和52%。这一发现为优化病毒冷冻保存protocol提供了重要参数。

不同品种的病毒保存效率

研究评估了微滴玻璃化法在不同树莓品种中保存三种病毒的效率。结果显示，RBDV在'ZK'和'TUM'品种中的保存率分别为86%和87%；RYNV在'ZK'、'FV'和'Stiora'品种中的保存率分别为86%、96%和94%；而BRNV在'ZK'和'TUM'品种中的保存率相对较低，分别为66%和45%。这些数据表明，病毒保存效率与病毒在茎尖组织中的分布特征密切相关，能够感染顶端分生组织的病毒(RBDV和RYNV)保存效率明显高于分布受限的病毒(BRNV)。

病毒活性验证

通过微嫁接实验，研究人员验证了解冻后病毒的生物活性。将冷冻保存后的病毒感染茎尖作为接穗或砧木，嫁接到健康植株上，通过原位杂交技术检测病毒在嫁接组合中的传播情况。实验结果显示，RBDV、BRNV和RYNV在嫁接后3天即可检测到微弱的病毒信号，7天和14天后信号明显增强，证实这三种病毒在解冻后仍保持完整的侵染能力。

蚜虫传播实验进一步验证了病毒解冻后的生物学功能。研究人员使用大型树莓蚜虫(Amphorophora idaei)进行传播实验，发现BRNV能够成功从冷冻保存的植株传播到健康植株，传播效率达到30%。然而，RYNV在实验中未能通过蚜虫传播，研究人员推测这可能与病毒株系特性有关，因为RYNV在'Lloyd George'品种中能够被蚜虫成功传播。这一发现提示病毒传播特性可能受病毒株系和宿主基因型共同影响。

讨论与结论

本研究成功建立了通过茎尖微滴玻璃化法冷冻保存树莓病毒的技术体系。研究结果表明，病毒在茎尖组织中的分布特征是影响冷冻保存效率的关键因素。能够感染顶端分生组织的病毒，如RBDV和RYNV，保存效率较高；而分布受限的病毒，如BRNV，保存效率相对较低。茎尖大小对保存效果也有显著影响，1毫米大小的茎尖在存活率、再生率和病毒保存率方面都表现最优。

病毒活性验证实验证实，冷冻保存后的病毒仍保持完整的生物活性和传播能力。微嫁接实验成功实现了三种病毒从冷冻保存材料到健康植株的传播，蚜虫传播实验进一步证明了BRNV解冻后仍具备媒介传播能力。这些结果为植物病毒资源的长期保存提供了可靠的技术支持。

研究还发现了一个有趣的现象：在'Stiora'品种的组织培养过程中，原本病毒检测为阴性的植株在培养6个月后重新检测到RYNV阳性。这一现象可能与病毒序列整合到植物基因组有关，类似于香蕉中内源性香蕉条纹病毒(endogenous banana streak virus, eBSV)的情况。虽然RT-PCR无法区分游离病毒和整合序列，这一发现提示在病毒保存和检测过程中需要考虑病毒与宿主基因组的复杂互作关系。

总体而言，该研究开发的茎尖冷冻保存技术为植物病毒资源的长期保存提供了有效解决方案，不仅适用于树莓病毒，也为其他作物病毒保存研究提供了重要参考。该技术在病毒学研究、抗病育种和病毒检测等领域具有广阔的应用前景，为植物病毒资源的可持续利用提供了重要技术支撑。