猪群中甲型流感病毒血清学检测方法的比较研究：HI抗原谱扩展与ELISA试剂盒的诊断性能评估

《Porcine Health Management》：Diagnostic performance of ELISA kits and expanded antigen panels for hemagglutination inhibition assays in pig herds enzootically infected with porcine Influenza A viruses

本研究针对地方性感染猪群中猪甲型流感病毒(swIAV)血清学监测的难题，比较了血凝抑制试验(HI)不同抗原谱与三种商业化ELISA试剂盒的诊断性能。结果表明，包含本地流行毒株的扩展HI抗原谱(HI 3)灵敏度最高(97.77%)，而间接ELISA(ELISA 1)适合大规模初筛(灵敏度95.69%)，竞争/阻断ELISA特异性更优。该研究为优化swIAV监测策略提供了重要依据，强调结合分子与血清学方法可提升诊断准确性。

　　

猪作为流感病毒的"混合容器"，在甲型流感病毒(IAV)跨物种传播中扮演着关键角色。猪甲型流感病毒(swIAV)不仅给养猪业造成经济损失，更因其人畜共患潜力而成为公共卫生的重要关注点。随着病毒不断进化，特别是高致病性禽流感病毒突破种间屏障的事件频发，建立有效的swIAV监测体系显得尤为重要。

然而，在实际生产中，swIAV的诊断面临诸多挑战。许多猪群呈现地方性感染特征，场内病毒流行率低(≤15%)，临床症状不典型，这给准确诊断带来了困难。此外，多种亚型病毒共循环、疫苗的广泛使用以及病毒抗原的多样性，都使得血清学检测结果的解读变得复杂。

目前，swIAV监测主要依赖血清学方法，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)和血凝抑制试验(HI)。ELISA操作简便、通量高，但不同试剂盒的性能存在差异；HI被认为是血清学分型的"金标准"，但其操作繁琐、成本较高，且检测效果高度依赖于所用抗原与流行毒株的匹配程度。面对这些挑战，慕尼黑大学等机构的研究人员开展了一项深入研究，比较不同血清学检测方法在地方性感染猪群中的诊断性能，相关成果发表在《Porcine Health Management》期刊上。

研究方法上，研究人员从德国25个已知swIAV地方性感染的种猪场采集了749份血清样本。这些农场规模从100到7000头母猪不等，其中10个场使用swIAV疫苗，15个场未免疫。研究比较了三种商业化ELISA试剂盒(间接ELISA、竞争ELISA和阻断ELISA)和四种HI抗原谱的诊断性能，其中HI抗原谱涵盖了经典毒株以及扩展的禽源和 pandemic 来源毒株。统计分析包括灵敏度、特异性、预测值和Cohen's Kappa一致性评估等指标。

血清学诊断在群体层面的表现

所有25个猪群均通过各血清学检测方法检出swIAV抗体。包含所有毒株的HI 4检测出722份(96.4%)阳性血清，而HI 1(仅含四种主要亚型)的阳性率为90%。间接ELISA(ELISA 1)的阳性检出率最高(93.5%)，竞争ELISA(ELISA 2)最低(78.8%)。

不同血清学检测方法之间的一致性

HI 4与HI 3(扩展pandemic毒株)之间的一致性最高(κ=0.779)。ELISA与HI assay之间的一致性普遍为中等或一般，其中间接ELISA与HI assay的一致性相对最高。竞争ELISA与阻断ELISA之间的一致性最高(κ=0.632)，而间接ELISA与这两种非间接ELISA格式之间的一致性一般(κ≈0.39)，提示检测方法原理影响结果一致性。

HI抗原谱扩展对诊断性能的影响

扩展抗原谱显著提升了检测性能。包含pandemic毒株的HI 3灵敏度最高(97.77%)，特异性及阳性预测值(PPV)均为100%，阴性预测值(NPV)为65.22%。而仅包含四种主要亚型的HI 1灵敏度(93.74%)和NPV(40.00%)最低。这表明包含本地流行毒株的扩展抗原谱能有效降低假阴性风险。

母猪胎次和所在区域对血清阳性的影响

经产母猪(≥2胎)的血清阳性率显著高于后备母猪(p=0.002)，其血清阳性 odds ratio 为3.032。然而，母猪在妊娠舍、配种舍或产房的不同位置，其血清阳性率无显著差异，提示病毒在猪场各单元循环较为均匀。

HI血清学诊断与RT-qPCR病毒学诊断的一致性

血清学检测在所有25个农场均检出swIAV暴露，而RT-qPCR仅在20个农场中检测到病毒RNA。在多个农场中，HI检测到了RT-qPCR未能发现的亚型抗体反应，例如在9个农场检测到H1 1A N1抗体，在5个农场检测到H1 1C N1抗体，而这些亚型并未在相应农场的PCR检测中出现。这种现象在未免疫农场中更为常见。

研究结论与讨论部分指出，该研究系统地评估了在swIAV地方性感染猪场中不同血清学检测方法的性能。间接ELISA(ELISA 1)凭借其高灵敏度(95.69%)和整体准确性(94.26%)，非常适合用于大规模群体筛查，尤其是在低流行率场景下。然而，其相对较低的特异性(60%)可能导致假阳性，进而高估血清阳性率。相比之下，基于竞争或阻断原理的ELISA(ELISA 2和3)表现出更高的特异性(83.33%和76.67%)，但灵敏度较低(81.36%和82.89%)，这限制了它们在全面检测感染个体方面的价值，特别是在筛查层面。

HI assay，尤其是包含本地流行毒株的扩展抗原谱(HI 3)，展现了最佳的总体诊断性能(灵敏度97.77%)，并能够提供PCR检测所遗漏的亚型水平信息。这凸显了HI在精确监测中的不可替代性，尽管其操作更为复杂且成本更高。

研究还发现，母猪胎次是血清阳性的显著影响因素，经产母猪因累积暴露风险而血清阳性率更高。将血清学(HI)与分子学(RT-qPCR)检测方法结合，能够优势互补：RT-qPCR用于检测急性期排毒，而血清学则能揭示过去的感染暴露史，发现低水平循环或PCR窗口期外的感染。

综上所述，这项研究强调，针对swIAV监测应采取分层诊断策略。在资源允许的情况下，使用高灵敏度的间接ELISA进行初筛，再结合高特异性的竞争ELISA或包含本地流行毒株的HI assay进行确认，并辅以RT-qPCR进行病毒检测，可以构建一个高效全面的监测体系。这种组合策略有助于更准确地掌握猪群swIAV的感染动态、流行亚型及其演变，对于制定有效的防控措施、减少经济损失以及评估公共卫生风险具有重要意义。同时，研究也指出，血清学检测试剂盒（尤其是NP-ELISA）的抗原成分需要根据流行毒株的演变及时更新，以保持其检测的广谱性和准确性。