应用双病毒刺突方法加速病毒清除的早期研究

《Biotechnology and Bioengineering》：Application of Dual Virus Spike Approach to Accelerate Early-Stage Viral Clearance Studies

病毒清除研究通过同时加注两种模型病毒（XMuLV和MMV）验证了与传统单病毒加料方法等效的灭活效率，显著减少实验次数（由四次降至两次），降低材料消耗28%，为加速生物药IND申报提供新策略。

　　在生物制药领域，病毒清除研究是确保产品安全性的关键环节。随着生物技术产品的广泛应用，尤其是基于哺乳动物细胞系（如中国仓鼠卵巢细胞，CHO细胞）的生产，病毒污染的风险始终存在。这种风险可能来源于细胞系本身或生产过程中意外引入的病毒。因此，按照国际协调会议（ICH）Q5A指南，必须对生产过程中已有的纯化步骤进行病毒清除/灭活能力的评估。病毒清除研究不仅对药物上市申请（IND）至关重要，也直接影响到产品的安全性和监管合规性。

传统的病毒清除研究方法通常采用“单病毒加标”策略，即每次实验仅对一种特定病毒进行加标，然后通过细胞感染性实验检测其在纯化过程中的清除情况。这种策略虽然能够准确评估每种病毒的清除效果，但需要大量的实验资源和时间，特别是在早期阶段的产品开发中，通常需要对至少两种模型病毒（如一种逆转录病毒和一种细小病毒）进行评估。这意味着，对于每个纯化步骤，都需要重复进行两次实验，以确保结果的可重复性，从而增加了整体成本和时间消耗。例如，在评估一个生物药物的病毒清除能力时，传统的做法是进行四次病毒加标实验，分别针对两种病毒，每次实验均需单独进行。

然而，近年来研究者们开始探索一种更高效的“双病毒加标”方法，即在同一个加标样品中同时加入两种模型病毒，并在后续的纯化步骤中分别检测它们的清除情况。这种方法的引入，不仅减少了实验次数，还显著降低了材料消耗和时间成本，从而为生物药物的IND申请提供了更加快速的途径。该方法的核心在于，通过合理的实验设计，确保两种病毒在加标后的检测过程中不会相互干扰，同时保持检测的准确性和可靠性。

在本研究中，我们评估了“双病毒加标”方法在四种典型的生物药物纯化步骤中的适用性，包括蛋白A捕获色谱、混合模式阴离子交换色谱（MM-AEX）、阳离子交换色谱（CEX）以及病毒保留过滤（VRF）。通过将两种病毒（XMuLV和MMV）同时加标，我们能够减少一半的实验次数，同时确保病毒清除数据的准确性。这种方法在实验设计上不仅减少了实验材料的需求，还优化了实验流程，使得病毒清除研究的执行更加高效。

在实际操作中，我们采用了与大规模生产相同的实验条件，并对实验材料进行了适当的规模缩减。实验过程中，所有步骤均遵循GMP标准，确保实验结果的可靠性和可重复性。对于蛋白A捕获色谱，由于其使用的低pH缓冲液具有灭活逆转录病毒的能力，我们采用了RT-qPCR方法进行病毒检测。而对于MMV，由于其对常规灭活方法具有较高的抵抗力，我们采用了细胞感染性实验（TCID50）进行检测。通过对比单病毒加标和双病毒加标实验的结果，我们发现两种方法在病毒清除能力方面具有良好的一致性，且双病毒加标方法在多个关键步骤中表现出了可接受的清除效果。

此外，实验还评估了双病毒加标方法对不同纯化步骤的影响。例如，在MM-AEX色谱中，双病毒加标实验显示，MMV的清除效果显著优于单病毒加标实验。这一差异可能源于多种因素，包括不同批次的树脂材料对病毒的处理能力、实验执行地点和检测方法的差异等。然而，这些差异并未影响整体的实验结果，且在允许的误差范围内。因此，我们可以认为，双病毒加标方法在大多数情况下能够提供与单病毒加标方法相当的清除数据，从而为加速病毒清除研究提供了可行的方案。

从实验结果来看，双病毒加标方法不仅提高了实验效率，还降低了实验成本。通过减少实验次数，我们能够显著减少所需的实验材料，如蛋白A捕获色谱的树脂和缓冲液，以及病毒保留过滤所需的滤膜。例如，在蛋白A捕获色谱中，双病毒加标方法仅需5个柱子，而单病毒加标方法需要7个柱子，从而节省了约29%的柱子和滤膜资源。这种节省不仅体现在实验材料上，还体现在人力成本和时间成本上，因为每个实验所需的人员投入减少了50%。

同时，双病毒加标方法的实施也为生物药物的开发流程带来了额外的灵活性。例如，在早期开发阶段，许多实验可能依赖于小规模或中试规模的生产数据，而这些数据通常已经用于毒理学研究或其他相关评估。通过采用双病毒加标方法，可以更高效地利用这些已有材料，减少对大规模生产材料的依赖，从而缩短整个开发周期。此外，由于双病毒加标方法减少了实验次数，实验可以在更早的时间点完成，从而为IND申请提供了更多的时间缓冲，避免因病毒清除研究而延迟其他关键步骤的进展。

在实际应用中，病毒清除研究通常由第三方实验室执行，以确保实验的独立性和安全性。然而，第三方实验室的费用较高，且实验周期较长。通过采用双病毒加标方法，不仅能够减少实验次数，还能够降低对第三方实验室的依赖，从而节省成本。此外，这种方法还能够提高实验的可重复性，因为每个实验均涉及两种病毒的检测，减少了实验设计的复杂性。

在进一步的研究中，我们希望探索“多病毒加标”方法的可行性，即在单个实验中同时检测三种或更多种病毒。这将为更复杂的病毒清除研究提供支持，尤其是在临床试验的后期阶段，如Phase III阶段，需要对更多种病毒进行评估。通过这种方法，我们不仅可以提高实验效率，还能够更好地理解不同纯化步骤对多种病毒的清除能力，从而为更全面的病毒清除评估提供依据。

综上所述，双病毒加标方法在病毒清除研究中展现出了显著的优势。它不仅能够减少实验次数，降低材料和人力资源的需求，还能够在保证实验准确性的同时，提高实验效率。这种方法的实施为生物药物的开发和IND申请提供了新的思路，有助于缩短开发周期，降低开发成本，并提升整体的实验可操作性。未来，随着检测技术的不断进步，我们有理由相信，多病毒加标方法将在更广泛的生物制药研究中得到应用，为病毒清除评估带来更多的可能性。