软性和硬性冠状结构中补体蛋白的分布影响巨噬细胞对纳米颗粒的摄取

《Advanced Healthcare Materials》：The Distribution of Complement Proteins in Soft and Hard Coronas Impacts Macrophage Uptake of Nanoparticles

蛋白冠中补体蛋白C3的分布及其对巨噬细胞摄取纳米颗粒的影响研究。采用PS-COOH、SMNs和Lips三种纳米颗粒，通过ELISA、Western blot和细胞摄取实验，发现C3片段在软冠（SC）中富集，而硬冠（HC）中的C3b通过补体受体介导巨噬细胞摄取。SC蛋白通过屏蔽HC结合的C3b减少巨噬细胞摄取，其动态特性阻止稳定受体结合。不同纳米颗粒的表面化学影响C3分布：PS-COOH和SMNs的C3片段主要在SC，而Lips因暴露氨基导致HC富集C3。该研究揭示了蛋白冠结构对纳米药物免疫逃逸的关键作用，为优化纳米载体设计提供机制依据。

　　在纳米医学领域，纳米颗粒（NPs）作为药物输送载体，其在体内的行为受到多种生物因素的影响。其中，补体蛋白的参与是决定纳米颗粒命运的重要环节。补体蛋白作为蛋白冠（protein corona, PC）的关键组成部分，能够促进免疫细胞对纳米颗粒的识别和清除，从而限制其在肿瘤部位的积累和治疗效果。然而，当前研究主要集中在补体蛋白在硬蛋白冠（hard corona, HC）中的作用，而对软蛋白冠（soft corona, SC）——这一动态层与生物系统直接接触——在补体激活和纳米颗粒清除中的作用却了解不足。本研究通过分析不同类型的纳米颗粒在多种人血清中的补体蛋白分布，揭示了SC在纳米颗粒与巨噬细胞相互作用中的重要角色。

纳米颗粒在血液中的行为受蛋白冠的影响，而蛋白冠由两层组成：HC和SC。HC蛋白与纳米颗粒结合紧密，具有较高的亲和力，并能长期稳定地附着在纳米颗粒表面；相比之下，SC蛋白则通过较弱且可逆的相互作用与纳米颗粒结合，其在血液中的分布具有动态性，容易与周围环境中的蛋白进行交换。这种差异使得SC在纳米颗粒识别和清除过程中具有独特的生物学意义。SC中的蛋白可能对纳米颗粒的清除起到关键作用，其动态特性可能影响其与细胞受体的稳定结合，从而改变巨噬细胞对纳米颗粒的吞噬行为。

补体蛋白的激活是纳米颗粒被清除的重要机制之一。当纳米颗粒进入血液循环后，它们可能通过经典的、凝集素的或替代的补体激活途径触发补体级联反应。这一过程会生成C3a和C5a等激活产物，同时C3b会被沉积在纳米颗粒表面，并进一步参与形成C5b-9膜攻击复合物（MAC）。MAC能够破坏细胞膜，从而导致纳米颗粒被巨噬细胞快速吞噬。此外，C3a和C5a的释放还可能引发过敏反应，降低纳米药物的临床转化潜力。因此，研究补体蛋白在纳米颗粒表面的分布及其对吞噬过程的影响，对于优化纳米药物的体内行为具有重要意义。

本研究中，我们以聚苯乙烯纳米颗粒（PS-COOH）为模型，探讨了补体蛋白在SC和HC中的分布情况及其对巨噬细胞吞噬行为的影响。通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）等手段，我们确认了PS-COOH的粒径和形态。随后，我们利用ELISA方法检测了不同表面面积浓度下PS-COOH在血清中激活补体的水平，发现C3a和C5a的浓度随纳米颗粒浓度增加而显著上升。此外，通过血溶素CH50实验进一步验证了PS-COOH的补体激活能力。结果显示，即使在较低的纳米颗粒浓度下，PS-COOH也能显著激活补体系统，这表明ELISA检测方法相较于血溶素法具有更高的灵敏度。

为了研究SC和HC中C3片段的分布，我们对纳米颗粒进行了离心处理，以分离出完整的蛋白冠（FC）和硬蛋白冠（HC）。通过Western blot和点印迹技术，我们发现FC中iC3b（C3的激活形式）的含量明显高于HC。这一结果表明，SC在纳米颗粒表面的C3沉积中具有显著优势。同时，通过对比不同预处理血清（如EDTA和Zymo）对C3沉积的影响，我们发现EDTA能够显著抑制iC3b在SC和HC中的沉积，而Zymo则通过激活替代途径增强了iC3b的沉积。这些发现强调了SC在补体激活过程中的动态特性，以及其在纳米颗粒清除中的潜在作用。

我们进一步探讨了SC中C3片段对巨噬细胞吞噬行为的影响。通过细胞实验，我们发现PS-COOH在SC和HC中的吞噬率存在差异，其中HC的吞噬率显著高于SC。这可能是因为SC中的蛋白会掩盖HC中的C3片段，从而减少其与巨噬细胞补体受体（CRs）的接触。此外，SC的动态特性也限制了其与细胞受体的稳定结合，从而降低了其在吞噬过程中的作用。相比之下，HC中的C3片段更容易被巨噬细胞识别，从而促进纳米颗粒的吞噬。这些结果表明，尽管SC在补体激活过程中可能扮演重要角色，但其在纳米颗粒与巨噬细胞的相互作用中可能起到抑制作用。

我们还研究了不同类型的纳米颗粒（如硅磁纳米颗粒SMNs和脂质体Lips）在SC和HC中的C3沉积情况。结果表明，SMNs和PS-COOH在SC中均表现出较高的iC3b沉积，而Lips则更倾向于在HC中沉积iC3b。这一差异可能与纳米颗粒表面化学特性有关，例如Lips表面的氨基基团可能通过硫酯-胺反应促进C3的沉积。这些发现为理解不同纳米颗粒在体内清除机制提供了新的视角，并强调了SC在纳米药物设计中的重要性。

此外，我们还分析了个体间血清差异对纳米颗粒补体激活和吞噬行为的影响。结果显示，不同个体的血清中，纳米颗粒引发的C5a水平存在显著差异，这可能与个体的补体活性和蛋白组成有关。同时，我们发现，在某些个体中，SC中的C3沉积与HC中的C3沉积存在显著相关性，这进一步说明了SC在补体激活过程中的作用。为了更全面地评估这些差异，我们采用了多种纳米颗粒类型，并在不同血清条件下进行了实验，以确保结果的普遍适用性。

最后，我们讨论了SC在纳米颗粒命运中的重要性，以及其动态特性对体内清除过程的影响。SC的可逆性和快速交换特性可能使其在纳米颗粒与免疫系统的相互作用中扮演重要角色，但同时也可能削弱其对吞噬过程的促进作用。因此，未来的研究应更加关注SC的动态行为，探索其在纳米药物设计中的潜在价值。此外，我们还指出，SC的分离和分析仍面临技术挑战，现有的分离方法可能无法准确反映SC的真实组成和功能。因此，开发更温和的分离策略和原位分析技术，将有助于更全面地理解纳米颗粒与免疫系统的相互作用机制。