综述：沙门氏菌的分子检测

《Journal of Food Protection》：Molecular detection of Salmonella

沙门氏菌分子检测技术综述，涵盖PCR、qPCR、WGS等传统方法及CRISPR-Cas、微流控芯片等新兴技术，重点分析invA、ttr等检测靶点及抗生素耐药基因（如bla、mcr）的分子机制，探讨灵敏度与特异性的平衡及未来便携式设备的发展方向。

　　### 中文解读：沙门氏菌分子检测技术的进展与挑战

沙门氏菌是一种在全球范围内广泛传播的食源性病原体，对公共健康构成了严重威胁。它属于肠杆菌科，主要包括沙门氏菌属和博氏沙门氏菌属两个物种。其中，沙门氏菌属又分为六个亚种，拥有超过2500种血清型。这些血清型中，某些类型对人类和动物具有致病性，主要分为非伤寒沙门氏菌（NTS）和伤寒沙门氏菌（TS）。NTS通常引起腹泻和侵袭性感染，而TS则主要引发伤寒，一种可通过人与人传播的传染病。根据世界卫生组织的报告，2021年全球约有715万例伤寒病例，导致近9.3万例死亡，主要集中于东南亚、东地中海和非洲地区。与此同时，NTS的感染负担也十分沉重，据全球疾病负担研究显示，它是导致食物中毒的主要原因之一，并在资源匮乏地区对健康造成显著影响。

随着抗生素耐药性的加剧，沙门氏菌的治疗难度也在不断上升。多药耐药（MDR）菌株，尤其是对氟喹诺酮类和第三代头孢菌素类药物产生耐药性的菌株，已经成为全球公共卫生的一大隐患。这些耐药菌株的出现不仅增加了治疗失败的风险，也提高了患者的死亡率。因此，快速而准确地检测沙门氏菌及其耐药性特征，对于及时干预、合理使用抗生素以及有效控制疫情具有重要意义。

传统的沙门氏菌检测方法主要依赖于培养技术和表型鉴定。这些方法通常包括预增菌、选择性增菌、分离、生化确认和免疫学鉴定等多个步骤，整个流程可能需要5至7天才能得到结果。此外，表型鉴定在检测低浓度细菌或处于存活但不可培养状态的细菌时，往往表现出较低的灵敏度。这种局限性在食物中毒事件中尤为明显，因为它们阻碍了早期预警系统的建立和快速响应。

相比之下，基于核酸的检测方法，如聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）、全基因组测序（WGS）等，因其高灵敏度、特异性和快速性，逐渐成为沙门氏菌检测的重要手段。这些分子技术不仅克服了传统方法的不足，还提高了检测效率和监控能力。本综述系统地总结了近年来沙门氏菌分子检测技术的发展，涵盖了用于检测的特定基因标记、耐药基因、分型技术以及新兴技术如CRISPR-Cas系统和微流控芯片。

在沙门氏菌的分子检测中，特定的遗传标记起着关键作用。例如，invA基因编码沙门氏菌III型分泌系统（T3SS）的核心蛋白，是沙门氏菌致病性的重要决定因素。invA基因在沙门氏菌属中高度保守，因此是分子检测中的常用靶标。hilA基因位于沙门氏菌致病性岛1（SPI-1）中，调控与入侵相关的基因表达。尽管某些非典型菌株中hilA基因存在变异，但它仍然是区分沙门氏菌与其他肠道细菌的重要标志。stn基因编码热稳定的肠毒素，与沙门氏菌引起的胃肠炎症状密切相关。ttr基因簇则涉及四硫磺酸呼吸，对于沙门氏菌在复杂样本中的检测具有高度特异性。这些基因标记构成了分子检测技术的基础。

在耐药基因检测方面，β-内酰胺酶基因如blaTEM、blaCTX-M和blaNDM等是沙门氏菌耐药性研究的重要靶标。其中，blaCTX-M基因在近年来的多药耐药菌株中尤为常见，而blaNDM基因则与碳青霉烯类药物耐药性有关。喹诺酮类耐药基因如qnrB和qnrS通过保护DNA促旋酶免受抑制，提供低水平耐药性。而mcr基因（如mcr-1至mcr-10）则通过改变脂多糖结构，使细菌对多粘菌素产生耐药性。这些耐药基因往往存在于质粒或可移动遗传元件中，通过水平基因转移在细菌间传播。因此，对这些基因的分子检测不仅有助于了解耐药性的传播机制，也为临床治疗和流行病学监测提供了重要依据。

检测技术方面，PCR技术因其高灵敏度和特异性而被广泛应用。传统PCR需要使用特定引物进行扩增，并通过凝胶电泳进行产物检测，尽管其操作简单且成本较低，但耗时较长，且缺乏定量能力。为了提高检测效率，近年来发展了多种改进技术，如多重PCR、qPCR和数字PCR（dPCR）。多重PCR能够在单次反应中同时扩增多个目标基因，提高了检测效率，同时还能用于沙门氏菌与其他病原体的联合检测。qPCR通过实时荧光监测技术，实现了对沙门氏菌的定量分析，且在某些情况下，如检测低浓度菌株时，表现出更高的灵敏度。dPCR则通过将PCR反应分为数千个微单元，实现对微量DNA的绝对定量，特别适用于低浓度样本的检测，但其设备成本较高，操作复杂。

等温扩增技术则为现场检测提供了新的解决方案。这类技术能够在恒定温度下进行核酸扩增，无需复杂的热循环过程，因此更加简便、快速且便于携带。其中，环介导等温扩增（LAMP）和重组酶介导的等温扩增（RPA）是目前最常用的两种方法。LAMP使用4至6种引物和一种能够进行链置换的DNA聚合酶，在60至65摄氏度下实现对目标DNA的高效扩增，能够在30至60分钟内完成检测。然而，LAMP需要设计多个引物，增加了非特异性扩增的风险，尤其是在背景微生物较多的样本中。RPA则利用重组酶、单链DNA结合蛋白和聚合酶，在37至42摄氏度下快速扩增DNA，通常在10至20分钟内完成。RPA技术对低纯度样本具有较好的耐受性，使其在复杂基质中的检测更加可靠。此外，RPA还被用于开发便携式检测设备，如结合侧向流动免疫分析（LFIA）的快速检测系统，能够在短时间内完成检测。

在分型技术方面，脉冲场凝胶电泳（PFGE）是一种基于DNA片段大小的分型方法，通过使用稀有切割酶消化细菌基因组，生成大DNA片段，并通过脉冲场电泳分离，形成独特的指纹图谱。PFGE具有高分辨率和良好的可重复性，常用于沙门氏菌的流行病学追踪和高分辨率需求场景。然而，PFGE需要较长的处理时间，通常需要3至5天，且标准化流程难以在不同实验室之间统一。因此，许多参考实验室已转向使用全基因组测序（WGS）作为替代方案。WGS不仅能够提供完整的基因组信息，还支持高分辨率分型、耐药基因和毒力基因的联合分析，以及进化研究。然而，WGS的高成本和对专业技术的依赖，限制了其在资源匮乏地区的广泛应用。

除了WGS，其他序列分析技术如多重序列分型（MLST）和靶向测序也得到了广泛应用。MLST通过分析多个管家基因的序列，定义序列类型（STs），具有标准化和高可重复性的特点，适用于长期监测和流行病学研究。然而，其分辨率有限，仅依赖于有限数量的管家基因，且无法提供关于抗生素耐药基因或毒力基因的详细信息。靶向测序则通过选择特定的基因区域进行高通量测序，能够在较低成本和较高深度下获取关键基因或突变信息，适用于快速检测特定基因或突变。

此外，熔解曲线分析（MCA）结合qPCR技术，能够通过监测DNA变性过程中的荧光变化，检测序列变异。MCA在沙门氏菌的快速分型中具有重要作用，尤其适用于血清型筛查。然而，该技术对目标基因序列的多态性较为敏感，无法区分所有血清型，并且需要预先的序列信息和实验设计支持。

在新兴技术方面，CRISPR-Cas系统因其独特的核酸识别和切割能力，成为沙门氏菌检测的重要工具。CRISPR-Cas技术能够提供高灵敏度和特异性的检测手段，同时通过分析CRISPR序列多样性实现高分辨率分型。例如，Fu等人结合RPA和CRISPR-Cas12a技术，开发了一种超灵敏的双重检测平台，可同时检测沙门氏菌的毒力基因（如invA）和耐药基因（如mcr-1），检测限低至1 CFU/mL。此外，CRISPR-Cas12a和CRISPR-Cas13a等不同类型的Cas蛋白，能够通过不同的机制实现信号检测，如通过切割荧光标记的ssRNA探针释放可检测的荧光信号。尽管CRISPR-Cas技术在检测灵敏度和特异性方面表现出色，但其在复杂样本中的应用仍面临样本预处理和标准化的挑战，如食品或粪便样本中需要复杂的核酸提取和纯化步骤以去除干扰物质。因此，进一步优化检测流程和降低操作复杂度是未来发展的关键方向。

微流控芯片技术作为一种集成化的检测平台，正在成为沙门氏菌检测的重要趋势。这种技术能够在微米尺度上操控液体，将样本处理、核酸扩增和检测集成在一个紧凑的设备中，从而实现自动化、高通量和便携式的检测。例如，Luo等人开发的微流控芯片能够在50分钟内完成沙门氏菌的检测，而Wu等人结合微流控技术与重组酶辅助扩增（RAA）技术，实现了对沙门氏菌的快速检测。然而，微流控技术在样本预处理、信号干扰和成本方面仍面临挑战，需要进一步简化操作流程、标准化验证以及跨学科合作，以推动其实用化。

尽管分子检测技术在沙门氏菌的检测中展现出显著优势，但在实际应用中仍存在诸多挑战。其中，灵敏度与特异性的平衡是一个重要问题。在复杂样本中，高灵敏度可能导致非目标核酸的非特异性扩增，从而产生假阳性结果。而当目标病原体浓度较低时，检测灵敏度不足则可能导致假阴性结果。此外，复杂样本中的干扰物质，如多糖、脂肪和酚类化合物，可能影响检测的准确性。因此，优化样本预处理步骤，如结合过滤和免疫磁分离技术，对于提高检测的灵敏度和特异性至关重要。

另一个重要挑战是成本和可及性。例如，WGS等先进检测技术成本较高，且需要专业的设备和人员，这在资源匮乏地区是一个显著障碍。为了提高这些技术的可及性，需要开发低成本、用户友好的分子检测设备，并加强在资源匮乏地区的技术支持和培训。此外，随着分子生物学和生物信息学的快速发展，沙门氏菌分子检测技术正朝着更高的效率、精度和智能化方向迈进。

未来，沙门氏菌分子检测技术的发展将更加依赖于跨学科的融合。便携式检测设备和优化的POCT技术将进一步提升检测的便捷性和效率。例如，便携式CRISPR-Cas设备已经能够实现与实验室标准相当的灵敏度和特异性，为现场检测提供了新的可能。此外，人工智能与微流控技术的结合，有助于开发全自动的“样本到答案”检测系统，从而提高检测的自动化水平和准确性。

综上所述，沙门氏菌作为一种重要的食源性病原体，对全球公共卫生构成了严重威胁。分子检测技术在沙门氏菌的防控中发挥着关键作用，其高灵敏度、特异性和快速性为早期诊断、流行病学监测和耐药性分析提供了重要支持。随着技术的不断进步和跨学科的深度融合，沙门氏菌的分子检测将更加精确、智能和具有全球适用性，为食品安全和耐药性管理提供坚实的科学基础。