探究KP27噬菌体内溶素对铜绿假单胞菌的固有抗菌活性：基于膜相互作用的实验与计算研究

《Journal of Molecular Biology》：Exploring the intrinsic antimicrobial activity of Klebsiella phage KP27 endopeptidase against Pseudomonas aeruginosa: insights into membrane interactions using experimental and computational approaches

本文深入探讨了克雷伯菌噬菌体KP27内肽酶（EndoKP27）对铜绿假单胞菌的固有抗菌机制，通过实验与模拟结合揭示了其通过N端阳离子区域破坏脂多糖（LPS）层并形成膜通道的新型作用模式，为研发抗革兰阴性菌药物提供了新策略。

　　

Highlight

EndoKP27展现出针对铜绿假单胞菌的固有抗菌活性，其作用不依赖于肽聚糖水解功能。

热灭活EndoKP27（HiEndoKP27）仍能破坏细菌膜完整性，表明其膜裂解能力与酶活性无关。

阳离子N端区域是EndoKP27膜相互作用的关键结构域。

分子动力学模拟显示EndoKP27可诱导细菌膜形成跨膜通道。

合成N端30肽对多种铜绿假单胞菌菌株具有抗菌活性。

Introduction

抗生素耐药性微生物的出现与传播是全球公共卫生的重大威胁。随着耐药性逐年加剧，噬菌体及其裂解酶作为安全且具潜力的治疗替代方案（或辅助工具）备受关注^1,2,3。过去十年间，噬菌体编码的内溶素（endolysins）作为新型抗菌剂，已在体外和动物模型中广泛研究，用于治疗局部感染如肺炎、皮肤感染、骨髓炎和肠道感染⁴。内溶素是噬菌体来源的肽聚糖降解酶，在裂解周期末期产生，通过裂解细菌释放噬菌体后代。在经典裂解系统中，内溶素需借助孔蛋白（holin）在细胞膜形成孔道以接触肽聚糖；而微孔蛋白（pinholin）则通过形成小孔去极化膜，激活具有信号锚定释放（SAR）结构域的内溶素^5,6。内溶素对缺乏外膜的革兰阳性菌特异性高，因其肽聚糖层暴露于表面⁷。相反，靶向革兰阴性菌的噬菌体内溶素通常具有更广的宿主范围^8,9。由于外膜屏障，这类内溶素常需修饰或与膜透化剂联用才能发挥活性，但部分内溶素具备直接（固有）抗菌活性¹⁰。外膜结构限制了内溶素的治疗应用，需克服此屏障才能靶向肽聚糖¹¹。目前已有多种针对革兰阴性菌的内溶素策略：（i）具有固有活性的天然内溶素，如广谱抗菌的SPN9CC¹²、靶向多重耐药（MDR）鲍曼不动杆菌的PlyF307¹³，以及针对MDR铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的极端噬菌体内溶素Ts2631¹⁴；（ii）基因改造内溶素（如Artilysins?），通过融合阳离子肽增强活性^15,16；（iii）联合外膜破坏剂（如EDTA、柠檬酸），例如铜绿假单胞菌内溶素EL188¹⁷和沙门氏菌内溶素Lys68¹⁸；（iv）与膜靶向抗生素（如多黏菌素）联用，如LysABP-01与黏菌素协同对抗鲍曼不动杆菌¹⁹，或ElyA1/ElyA2联合黏菌素靶向MDR菌株²⁰。现有研究多聚焦于内溶素与透化剂的协同作用，而对非修饰内溶素的直接活性及结构功能关系探索较少。本研究以克雷伯菌噬菌体vB_KpnM_KP27的内溶素EndoKP27为对象，此前我们发现其具有内肽酶活性，可切割肽聚糖中L-丙氨酸与D-谷氨酸间的肽键，并具备良好的pH和热稳定性²²。EndoKP27与阳离子树状聚合物²³或gasdermin D_Nterm孔道蛋白²⁴联用时可增强抗铜绿假单胞菌活性。本文首次证实EndoKP27在天然免疫透化剂存在下，对假单胞菌目细菌（如铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌）的体外和体内活性均提升。更重要的是，EndoKP27属于罕见具备固有活性的内溶素，但其缺乏此类蛋白的典型特征：C端两亲性α螺旋（如铜绿假单胞菌噬菌体内溶素Pae87²⁵或大肠杆菌噬菌体内溶素PlyE146²⁶）和N端SAR结构域（如沙门氏菌噬菌体内溶素LysKpV475²⁷），仅保留富集阳离子残基的N端区域。我们通过分析EndoKP27对不同LPS结构及多黏菌素敏感性各异的铜绿假单胞菌菌株的透化作用，结合脂质体模型和分子动力学模拟，揭示了其与细菌膜的相互作用机制，并验证合成N端肽的抗菌潜力。实验与模拟相结合，提出了非修饰内溶素通过LPS去稳定化和膜裂解作用致敏铜绿假单胞菌的新机制。