橙皮素抗牙科生物膜白色念珠菌的潜力研究：一种新型天然抗真菌剂的发现

《Journal of Oral Biology and Craniofacial Research》：Possible applicability of flavonoid hesperetin for the treatment of dental biofilm-forming Candida glabrata

本研究针对牙科感染中白色念珠菌(Candida glabrata)生物膜形成导致的抗真菌治疗失败难题，系统评估了多种植物化合物（槲皮素、桑色素、芦丁、柚皮苷、橙皮素）的抗真菌及抗生物膜活性。结果表明，橙皮素(hesperetin)展现出最优异的抗菌效果（MIC: 0.3±0.01 mM，ZOI: 14.6±0.57 mm），并在2MIC(0.6 mM)浓度下可100%清除成熟生物膜。尤为重要的是，其血液相容性评估显示在高达10 mM浓度时溶血率仍低于5%，表明其具有良好的生物安全性。该研究为开发基于植物源成分的安全有效抗真菌疗法提供了重要实验依据，对解决临床耐药难题具有积极意义。

　　

在口腔健康领域，真菌感染正日益成为全球性的公共卫生挑战。过去几十年间，真菌感染的发生率持续攀升，其中白色念珠菌(Candida glabrata)因其卓越的生物膜形成能力，已成为牙科相关感染的主要病原体之一，占所有感染的50-70%。这种机会性病原体特别容易在免疫力低下个体中引发严重系统性感染。牙齿表面为白色念珠菌的定植提供了理想环境，使其能够附着并嵌入保护性胞外多糖基质中，这种生物膜结构极大地阻碍了常规抗生素的治疗效果。

牙科生物膜的形成是一个复杂多阶段过程，包括细胞粘附、增殖、胞外基质产生与积累以及最终细胞分散。白色念珠菌形成的生物膜由嵌入自我产生胞外基质中的微生物细胞组成，该基质不仅作为物理屏障，还支持真菌在生长阶段的存活和持久性，从而导致抗真菌治疗失败。目前临床主要使用氟康唑、棘白菌素或多烯类等抗真菌药物，但长期或不合理使用这些药物会促使耐药性发展。因此，寻找新型替代治疗方案迫在眉睫。

在这一背景下，植物来源的化合物因其低分子量和多种治疗功能而受到医学研究的广泛关注，世界卫生组织也推荐将其作为替代药物。多酚类化合物广泛存在于植物资源中，其中橙皮素(hesperetin)因其增强的抗氧化、抗炎和抗菌特性而备受关注。尽管已有研究表明橙皮素能够破坏白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的混合成熟生物膜，但迄今为止，关于橙皮素对抗白色念珠菌活性的研究仍属空白。为此，研究人员在《Journal of Oral Biology and Craniofacial Research》上发表了最新研究成果，系统评估了橙皮素作为替代选择治疗牙科生物膜形成白色念珠菌的抗真菌和抗生物膜效果。

本研究采用多种关键技术方法进行评估。研究人员从32份口腔感染标本中筛选分离白色念珠菌临床菌株，并通过VITEK?2 compact系统进行鉴定。抗真菌活性通过抑菌圈(ZOI)和最小抑菌浓度(MIC)测定进行评估；抗生物膜潜力通过结晶紫(CV)染色、MTT法和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)分析进行验证；通过人红细胞溶血试验评估橙皮素的生物相容性。所有实验均设三重重复，数据通过单因素方差分析进行统计处理。

3.1. 白色念珠菌的筛选与鉴定

从32份口腔感染标本中，共分离出7株念珠菌属菌株。其中6株为白色念珠菌（呈现浅绿色菌落），1株（分离株3）被鉴定为白色念珠菌（呈现淡紫色至紫色菌落）。临床分离的白色念珠菌菌株与参考菌株白色念珠菌ATCC90030进行了验证，显示完全一致的菌落形态特征。

3.2. 抗真菌活性评估

所有测试的植物化合物（槲皮素、桑色素、姜黄素、芦丁、柚皮苷和橙皮素）均对临床分离的白色念珠菌表现出抗真菌活性。其中，橙皮素显示出略高的抗真菌活性（ZOI：14.6±0.57 mm）。橙皮素对白色念珠菌的MIC值为0.3±0.01 mM，而其他植物化合物的MIC值在0.4 mM至1.0 mM之间。

3.3. 抗生物膜活性评估

在生物膜形成预防实验中，橙皮素在0.5MIC浓度下可实现33.3±1.6%的生物膜减少，而在1MIC浓度下所有植物化合物的生物膜形成减少率均超过90%。在成熟生物膜清除实验中，MTT结果表明，橙皮素在1MIC浓度下对7天成熟生物膜可实现28.0±1.6%的细胞抑制，而在2MIC浓度下可观察到白色念珠菌生物膜中细胞100%死亡。CLSM分析进一步验证了这些结果，显示在2MIC橙皮素处理24小时后，98.7±0.57%的细胞被抑制。

3.4. 血液相容性测定

橙皮素对人红细胞的溶血活性测定显示，在高达10 mM浓度下，溶血率仍低于5%，符合美国材料试验协会对类黄酮生物相容性的标准（溶血率应低于5%），表明橙皮素在治疗过程中对宿主系统具有血液相容性。

研究结论与讨论部分强调，牙科生物膜形成的真菌感染严重且难以治疗。本研究首次系统评估了橙皮素对牙科生物膜形成白色念珠菌的抗真菌和抗生物膜功效。多模式方法结合CV染色、MTT法和CLSM研究，通过评估生物量（CV）、代谢活性（MTT）以及二维结构和活死细胞分析（CLSM）等不同参数，为生物膜评估提供了有效可靠的方法。橙皮素不仅抑制浮游细胞，还能破坏生物膜基质，这对治疗持续性口腔感染具有重要意义。

橙皮素的抗菌和抗生物膜机制可能涉及多种因素，包括细胞膜完整性破坏、线粒体功能障碍、活性氧(ROS)积累、严重氧化应激、群体感应(QS)干扰以及抑制胞外聚合物产生等。尽管本研究突出了橙皮素作为抗白色念珠菌抗真菌和抗生物膜剂的潜力，但在牙科实际应用前仍需解决几个局限性：仅评估了一株临床分离株，限制了结果 across 菌株变异的普适性；研究在体外条件下进行，需要体内模型验证；未与标准抗真菌药物进行联合或协同作用研究；缺乏作用机制方面的检测等。

该研究得出结论：植物化合物槲皮素、桑色素、姜黄素、芦丁、柚皮苷和橙皮素对牙科生物膜形成白色念珠菌表现出潜在的抗真菌和抗生物膜活性。橙皮素在2MIC(0.6 mM)浓度下表现出优异的抗生物膜潜力(98.7-100%)，最重要的是，其在高达10 mM浓度下显示出可接受的溶血水平(<5%)，表明它是一种安全且血液相容性良好的生物材料。因此，本研究强调橙皮素是未来抗牙科生物膜形成白色念珠菌药物开发的潜在安全替代候选物。