苹果酸交联玉米醇溶蛋白纳米粒作为新型载体增强姜黄素抗氧化活性的研究

《LWT》：Preparation of malic acid cross-linked zein nanoparticles as novel vehicles for enhancing the antioxidant activity of curcumin

本研究针对姜黄素(Cur)水溶性差、稳定性低的问题，通过苹果酸(MA)交联玉米醇溶蛋白(zein)构建了新型纳米载体ZCM NPs。结果表明，当MA与zein质量比为1:5时，ZCM NPs粒径为164.20±3.67 nm，包封率达76.54%，且能显著提升Cur的胃肠释放率（93.10%）、细胞摄取效率及DPPH/ABTS自由基清除能力。该研究为疏水性活性成分的递送提供了安全高效的纳米平台，在功能性食品领域具有应用潜力。

　　

姜黄素(Curcumin, Cur)作为一种天然植物多酚，具有抗炎、抗癌、抗氧化和伤口愈合等多种生物活性，在功能性食品和医药领域展现出广阔的应用前景。然而，姜黄素极差的水溶性和不稳定性严重限制了其实际应用。在加工、储存和消化过程中，姜黄素容易发生降解，导致生物利用度大幅降低。为了解决这一难题，研究人员尝试利用各种递送系统（如乳液、水凝胶、纳米颗粒）对姜黄素进行包封，以期提高其稳定性和生物活性。传统的合成聚合物载体在制备过程中常使用有机溶剂，可能带来潜在的毒性风险。因此，开发安全、生物相容性好的天然大分子材料作为递送载体成为研究热点。

玉米醇溶蛋白(zein)是从玉米中提取的一种酒精溶性蛋白，因其无毒、生物相容性好、来源广泛、可生物降解且成本低廉，被公认为安全的食品级物质。其分子中同时含有大量疏水氨基酸和一些亲水氨基酸，这种两亲性使其能够通过一步反溶剂法自组装成纳米颗粒，用于包载姜黄素、白藜芦醇、槲皮素等生物活性化合物。然而，单独由玉米醇溶蛋白制备的纳米颗粒在特定环境胁迫下（如高盐浓度、剧烈光热条件）稳定性较差。近年来研究发现，通过与亲水性生物物质交联，可以有效改善玉米醇溶蛋白纳米颗粒的稳定性。但常用的交联剂如戊二醛、甲醛等存在毒性高、制备工艺复杂等问题。与之相比，苹果酸(Malic Acid, MA)作为一种天然存在的二羧酸，是人体内代谢循环的重要中间体，具有安全性高、制备简单、无毒等优点，是一种理想的食品添加剂。

基于此，广西大学的研究团队在《LWT》期刊上发表论文，首次提出利用苹果酸作为交联剂，构建负载姜黄素的玉米醇溶蛋白/苹果酸复合纳米颗粒(Cur-loaded zein/malic acid composite nanoparticles, ZCM NPs)，旨在增强姜黄素的稳定性、生物可利用度及其抗氧化活性。

本研究采用一步反溶剂法制备ZCM NPs。通过优化确定苹果酸与玉米醇溶蛋白的最佳质量比为1:5。利用动态光散射(DLS)测定纳米粒的粒径、多分散指数(PDI)和Zeta电位，透射电子显微镜(TEM)观察形貌，傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析分子间相互作用，紫外-可见光谱(UV-Vis)和荧光光谱进行光谱学表征，X射线衍射(XRD)和差示扫描量热法(DSC)分析晶体结构和热行为。并系统评估了纳米粒的离子强度稳定性、长期储存稳定性、光化学稳定性和热稳定性。通过模拟胃肠道消化实验研究姜黄素的释放行为，利用细胞实验（Caco-2细胞和RAW 264.7细胞）评估纳米粒的细胞摄取能力和细胞内抗氧化活性（包括DPPH和ABTS自由基清除实验以及细胞内活性氧(ROS)检测）。

3.1. 制备与质量比优化

研究人员通过一步反溶剂法成功制备了ZCM NPs。当MA与zein质量比为1:5时，纳米颗粒表现出最小的粒径（164.20 ± 3.67 nm）、均匀的分布（PDI = 0.15 ± 0.04）和最高的包封率（76.54 ± 0.77%），故选择此比例进行后续研究。

3.2. ZCM NPs的表征

ZCM NPs的平均粒径为164.20 ± 3.67 nm，Zeta电位为-24.00 ± 2.42 mV，有利于纳米颗粒的稳定性。TEM图像显示ZCM NPs呈球形且分散均匀。

3.3. FT-IR分析

FT-IR光谱证实了ZCM NPs中MA的羧基与zein的氨基之间发生了交联反应，形成了新的酰胺键，并且姜黄素被成功包封在纳米颗粒内部。

3.4. 光谱学评估

UV-Vis和荧光光谱显示，与游离Cur相比，ZC NPs和ZCM NPs中Cur的最大吸收峰和发射峰均发生蓝移，表明Cur与载体之间存在分子间相互作用（如疏水相互作用）。

3.5. 晶体结构分析

XRD和DSC结果表明，包封后的姜黄素在ZCM NPs中以无定形态存在，这有利于提高其溶解度和生物利用度。

3.6. 体外胃肠道消化

在模拟胃肠液消化实验中，ZCM NPs中的姜黄素在6小时内的累积释放率达到93.10%，显著高于游离姜黄素（30.48%），表明ZCM NPs能有效促进姜黄素在胃肠道的释放。

3.7. 离子强度稳定性

在NaCl浓度低于100 mM时，ZCM NPs表现出良好的稳定性。在高盐浓度（200 mM）下，ZCM NPs的粒径增加幅度小于ZC NPs，表明MA的引入增强了纳米颗粒的离子强度稳定性。

3.8. 储存稳定性

在25°C、60%相对湿度下储存15天后，ZCM NPs的粒径仅从167.57 nm增加至216.70 nm，且沉淀现象明显少于ZC NPs，显示出优异的长期储存稳定性。

3.9. 热稳定性和光化学稳定性

经过80°C热处理后，ZCM NPs中姜黄素的保留率（81.84%）显著高于ZC NPs和游离Cur。经过90分钟紫外线照射后，ZCM NPs中姜黄素的保留率（75.17%）也高于ZC NPs（60.60%）和游离Cur。降解动力学分析表明ZCM NPs具有更长的半衰期(t_1/2)，说明其能更好地保护姜黄素免受光和热的降解。

3.10. 细胞摄取

CLSM和流式细胞术结果显示，与游离Cur相比，ZCM NPs在Caco-2细胞中的摄取效率更高，且具有时间依赖性，培养6小时后荧光强度约为游离Cur的2.36倍。

3.11. 抗氧化活性

DPPH和ABTS自由基清除实验表明，在所有测试浓度下，ZCM NPs的自由基清除能力均显著强于游离Cur，表现出增强的体外抗氧化活性。

3.12. 细胞内ROS清除能力

在LPS诱导的RAW 264.7细胞中，ZCM NPs处理组细胞内的ROS荧光强度显著低于游离Cur处理组和LPS模型组，表明ZCM NPs能更有效地清除细胞内的活性氧，具有更强的细胞内抗氧化能力。

综上所述，该研究成功开发了一种以苹果酸交联的玉米醇溶蛋白纳米颗粒作为姜黄素的新型递送系统。ZCM NPs具有粒径小、分布均匀、包封率高、稳定性好等优点，能显著提高姜黄素在模拟胃肠道环境中的释放率、细胞摄取效率以及体外和细胞内抗氧化活性。该研究为解决疏水性生物活性物质（如姜黄素）在实际应用中面临的溶解性差、稳定性低、生物利用度不高等问题提供了了一种安全、有效且具有应用前景的纳米策略，有望在功能性食品和医药领域发挥重要作用。