基于手机明场成像的微滴数字LAMP技术用于核酸精准定量分析

《Microchemical Journal》：Cellphone-based bright field quantification of droplet digital loop-mediated isothermal amplification (ddLAMP)

本文报道了一种创新的手机明场成像系统，用于微滴数字环介导等温扩增（ddLAMP）的核酸定量检测。该研究通过利用LAMP反应副产物焦磷酸镁沉淀作为信号标志，仅需商用手机外接镜头即可实现100微米级微滴的精准识别，无需复杂光学滤光片。实验表明该方法对霍乱弧菌DNA的检测动态范围达2–650 copies/μL，与荧光显微镜结果高度吻合（相关系数0.9980），为现场即时检测（POC）提供了低成本、便携化的数字核酸定量新方案。

　　

在精准医疗和传染病防控领域，核酸的精准定量检测犹如一把“分子尺”，能够精确测量病原体或特定基因的拷贝数。传统的实时荧光定量PCR（qPCR）和环介导等温扩增（LAMP）技术虽已广泛应用，但无法实现绝对定量。数字核酸分析技术将反应体系分割成数万个微滴，通过统计阳性微滴比例直接计算目标分子数量，成为突破定量瓶颈的关键。然而，现有数字检测设备依赖笨重的荧光显微镜或流式细胞仪，其复杂的光学系统和高昂成本严重制约了在基层医疗或资源匮乏地区的推广应用。

近日发表于《Microchemical Journal》的研究论文中，西弗吉尼亚大学的Bethany J. Fike、Brandi Binkley、刘正儒和李鹏团队创新性地将智能手机与微滴数字LAMP（ddLAMP）技术结合，开发出一种仅需商用手机外接镜头即可实现核酸精准定量的便携式检测平台。该技术的核心突破在于利用LAMP反应过程中自然产生的焦磷酸镁（Mg₂P₂O₇）沉淀作为检测信号——当反应微滴中存在目标核酸时，扩增过程会生成白色沉淀物聚集于微滴底部，通过手机明场成像即可区分阴阳性微滴，巧妙规避了荧光检测所需的光学滤光片和激发光源。

研究团队通过四个关键技术环节构建完整检测体系：采用振动尖头毛细管装置生成单分散微滴（直径100-350微米），通过优化dNTP和MgSO₄浓度确认标准反应条件（8 mM）即可满足沉淀形成需求，设计3D打印定位支架固定手机与样品池确保成像重复性，并建立基于图像灰度值分析的自动判读算法（阈值设为阴性微滴平均灰度值加三倍标准差）。特别值得注意的是，该系统对霍乱弧菌（Vibrio cholerae）DNA的检测性能与荧光显微镜高度一致，在2–650 copies/μL范围内呈现优异线性关系。

在成像系统优化方面，研究人员发现7.0毫米物距配合黑色吸光背景可显著提升图像信噪比。通过对比不同照明条件（环境光、暗室、遮光盒等），证实消除反射光对沉淀识别至关重要。针对微滴尺寸极限的测试表明，当前系统可稳定识别直径100微米（0.5 nL）的微滴，更小尺寸则因焦距限制难以清晰成像。

值得关注的是，该方法首次实现了手机明场成像对微升尺度反应体系的精准量化。与需要复杂改装手机的荧光检测方案相比，该平台仅需APEXEL品牌外接显微镜镜头（100倍放大，含偏振镜），无需任何荧光标记或流体控制单元。实验数据表明，手机检测与荧光显微镜的定量结果具有0.9981的皮尔逊相关系数，且动态范围完全覆盖临床常见病原体检测需求。

该研究的成功不仅为现场即时检测提供了创新工具，更开辟了“沉淀信号”在微型化检测装置中的应用前景。研究者指出，未来通过开发集成图像识别算法的手机应用软件，并结合便携式核酸提取模块，有望构建真正一体化的现场核酸定量系统。尽管当前技术对100微米以下微滴的检测仍存挑战，但这项研究无疑为突破专业设备依赖、推动数字检测技术普惠化迈出了关键一步。