建立了一种高性能的化学同位素标记液相色谱-质谱（LC-MS）方法，用于全面分析血清中的胆汁酸成分，并基于一项病例对照研究将其应用于妊娠期肝内胆汁淤积症的生物标志物发现

《Microchemical Journal》：Establishment of high-performance chemical isotope labeling LC-MS method for comprehensive profiling of serum bile acids and its application in biomarker discovery for intrahepatic cholestasis of pregnancy based on a case-control study

化学同位素标记（CIL）结合液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术实现了胆汁酸（BA）的高效定性与定量分析，通过d4-DMED与d0-DMED同位素对标记羧基，显著提升离子化效率与色谱分辨率，成功鉴定108种血清BA（55种经标准品验证）。病例对照研究发现15种BA在ICP患者中显著改变（p<0.001），VIP评分>1.5，筛选出10个代谢物比值作为诊断生物标志物（灵敏度>92%，特异性>94%），为BA代谢紊乱相关疾病研究提供新方法。

　　这项研究介绍了一种基于化学同位素标记（CIL）与液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术的新方法，用于全面分析人血清中的胆汁酸（BAs）代谢情况。该方法通过使用一种特定的同位素标记试剂——d₄-二甲基乙二胺（d?-DMED），以及其未标记的对照物d?-DMED，实现了对胆汁酸分子中羧基功能团的高效标记。这种方法不仅提高了分析的精确度，还增强了代谢物识别的可靠性。

胆汁酸主要在肝细胞中合成，随后被释放到胆汁中，并通过胆管输送到小肠。除了其传统的促进脂溶性营养物质吸收的作用外，胆汁酸还作为重要的信号分子，调节多种代谢功能，包括葡萄糖稳态、脂质代谢和能量调控，主要通过肠道-肝脏轴实现。在生理条件下，胆汁酸大多通过肠肝循环被重新吸收，只有极少量进入全身循环或通过尿液排出。然而，在多种病理状态下，如胆汁淤积、肥胖、2型糖尿病、肝细胞癌（HCC）和结直肠癌等，胆汁酸的组成和循环浓度会发生显著变化。这些发现强调了系统性胆汁酸谱分析在疾病诊断、预后评估和治疗监测中的临床重要性。

妊娠期肝内胆汁淤积（ICP）是一种病因不明的妊娠期肝脏疾病，临床特征包括孕妇的瘙痒症状和血清中总胆汁酸（TBA）水平升高。这种疾病对胎儿具有重大风险，如早产、胎儿缺氧，甚至在严重情况下可能导致胎儿宫内死亡。因此，血清中总胆汁酸水平的升高被认为是ICP诊断中最可靠的生化指标。然而，为了排除其他可能导致TBA升高的肝胆疾病，仍需进行鉴别诊断。值得注意的是，比较分析表明，ICP患者的胆汁酸谱与健康孕妇存在显著差异，某些特定的胆汁酸种类可能作为诊断ICP的生物标志物或治疗效果的评估指标。因此，建立一种精确且敏感的胆汁酸代谢分析方法对于ICP的临床管理至关重要。

近年来，液相色谱-质谱联用技术（LC–MS）已成为分析多种生物基质中胆汁酸的主流方法，如血浆、血清、尿液和粪便样本。然而，实现对胆汁酸亚代谢组的全面覆盖仍然面临技术挑战。这些挑战主要源于胆汁酸的结构多样性、其在生物流体中的广泛动态浓度范围、未结合胆汁酸的低电离效率，以及缺乏真正的标准品或同位素标记的内标物。为了解决这些问题，高性能化学同位素标记（CIL）技术已被越来越多地应用于LC–MS流程中。通过化学衍生化，可以在代谢物池中引入一个稳定的同位素编码标签，从而为每个标记的分析物生成同位素内标物。这一策略不仅有助于实现准确的相对定量，还能通过改变目标代谢物的理化性质，提高色谱分辨率和质谱响应。

在本研究中，基于我们之前发现，将特定的功能基团引入胆汁酸结构可以显著提升其电离效率和色谱分辨率，我们引入了一种新的CIL-LC-MS方法，用于全面识别和相对定量人血清中的胆汁酸。该方法采用了一对同位素标记试剂——N,N′-二甲基乙二胺（d?-DMED）及其氘代形式d?-DMED，用于对胆汁酸分子中的自由羧基进行快速和定量的标记。考虑到所有未结合和结合的胆汁酸都是由胆酸（CA）或脱氧胆酸（CDCA）生物合成而来，理论上可以预测其结构变异。因此，我们利用DMED在碰撞诱导解离（CID）过程中表现出的特征中性丢失，构建了一个全面的前体离子到产物离子的过渡库。该标记化学的关键特性在于，在CID条件下，二甲基氨基基团能够轻松断裂，形成中性丢失碎片。因此，重标记和轻标记的胆汁酸对在质谱分析中展现出相同的产物离子谱，但前体离子质量和中性丢失质量有所不同。这种设计使得同位素标记对能够共洗脱并共碎片化，同时它们的质谱信号被独立记录。通过将d?标记的物种作为d?标记分析物的内标，可以有效校正基质效应和离子抑制现象。最终，这种方法使得通过多反应监测（MRM）技术对血清中的胆汁酸代谢物进行全面分析成为可能，提供了高灵敏度和可靠的定量性能。

此外，该方法也适用于病例对照代谢组学研究，用于识别与ICP相关的血清生物标志物。因此，它为理解疾病机制和探索可能的治疗干预措施提供了新的视角。通过这种方法，研究人员能够更深入地了解ICP患者的胆汁酸代谢特征，包括未结合胆汁酸水平降低，以及甘氨酸结合和牛磺酸结合胆汁酸水平升高等现象。这些发现不仅有助于提高ICP的诊断准确性，也为相关疾病的治疗策略提供了新的思路。

在实验设计方面，研究团队采用了一种创新的方法，通过混合126个妊娠样本的等体积液体，构建了一个复合样本。在提取后，将复合样本分为两部分，一部分使用d?-DMED（轻标记）进行衍生化，另一部分使用d?-DMED（重标记）进行处理。这两部分随后按1:1的比例混合，以确保分析的准确性和一致性。这种方法不仅提高了样本处理的效率，还减少了实验误差，从而保证了结果的可靠性。

在实验过程中，研究团队使用了来自四个供应商的共91种胆汁酸参考化合物，包括45种未结合胆汁酸和46种结合胆汁酸。这些化合物为实验提供了必要的标准品，确保了分析的准确性和可重复性。此外，实验中还使用了多种高纯度溶剂，如HPLC级甲醇、乙腈、甲酸铵和冰醋酸，以及自制的超纯水，以满足LC-MS分析的严格要求。这些试剂的选择和使用体现了实验设计的严谨性和对结果质量的高度重视。

研究团队还特别强调了实验的伦理规范和知情同意。所有参与研究的参与者均提供了书面同意，确保了研究的合法性和伦理性。同时，该研究遵循了所有适用的国家指南和机构规定，并符合《赫尔辛基宣言》（2013年修订版）的原则，获得了作者所在机构（北京大学第三医院）的伦理审查委员会批准。这些措施不仅保障了研究的合规性，也体现了对研究对象权益的尊重。

在作者贡献方面，所有作者都对本文的撰写和研究内容承担了全部责任，并同意提交该论文。具体而言，Xin Xiong负责原稿撰写、项目管理、方法设计、资金获取、数据整理和概念设计；Xunke Gu负责审稿和资源协调；Yuanhui Jiang负责监督和资源管理；Xianhua Zhang负责审稿、验证、方法设计和资金获取；Keke Jia负责软件开发和资源管理；Xiaona Li负责方法设计和实验调查；Libo Zhao负责监督和实验调查；Yuan Wei负责审稿、资源协调和概念设计。每位作者的贡献都得到了充分的认可，确保了研究的全面性和科学性。

在研究资金方面，该研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：82172367、81672107和21405007）以及国家重点研发计划（项目编号：2022YFC3401205）的支持。这些资金的投入为研究提供了必要的资源和保障，确保了实验的顺利进行和结果的可靠性。

通过这项研究，团队成功开发了一种新的CIL-LC-MS方法，用于对血清中的胆汁酸进行相对定量分析。该方法不仅提高了胆汁酸代谢分析的精确度和覆盖范围，还为疾病的诊断和治疗提供了新的工具和思路。特别是在ICP的研究中，该方法的应用使得研究人员能够更准确地识别与该疾病相关的血清生物标志物，从而为临床实践提供有力的支持。此外，该方法的可扩展性和灵活性也使其适用于其他与胆汁酸代谢异常相关的疾病研究，具有广泛的应用前景。