基于Zr-MOF封装磁性珠子的快速高效偶联策略，用于灵敏的免疫检测和类风湿性关节炎的早期诊断

《Microchemical Journal》：Zr-MOF encapsulated-magnetic beads-based fast and efficient conjugation strategy for sensitive immunoassays and early diagnosis of rheumatoid arthritis

抗环 citrullinated 多肽抗体（anti-CCP）是类风湿关节炎早期诊断的关键生物标志物。本研究开发了一种基于锆基金属有机框架（Zr-MOF）的磁珠载体（MB@MOF），通过一步物理化学吸附法高效修饰streptavidin（SA），显著缩短传统化学交联法（EDC/NHS）所需时间（至少6倍）并消除化学试剂依赖。MB@MOF载体通过Zr-MOF纳米颗粒的丰富羧基功能基团与SA的羧基形成稳定的配位键，实现SA的高密度负载（荧光强度达140,000）。优化后的CLIA方法检测限为0.1 RU/mL，线性范围0.5–200 RU/mL，与临床标准分析仪的检测结果高度一致（诊断准确率91.7%）。该策略不仅简化了 immunoassay 工艺，还提升了检测灵敏度和抗干扰能力，为类风湿关节炎快速诊断提供新方案。

　　抗环瓜氨酸肽（anti-CCP）抗体是类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）的重要生物标志物，对于疾病的早期诊断和病情监测具有关键意义。传统的化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay, CLIA）依赖于生物素功能化的磁珠（streptavidin-functionalized magnetic beads, SA-MBs），但这类磁珠存在结合位点有限以及需要耗时且繁琐的化学偶联步骤等缺点。为此，本研究提出了一种基于锆基金属有机框架（zirconium-based metal-organic frameworks, Zr-MOFs）修饰的磁珠载体（MB@MOF），通过一步物理化学吸附实现快速、高效的SA功能化。与传统的EDC/NHS方法相比，该方法将修饰时间缩短了至少六倍，并且无需使用化学交联剂，从而保留了SA的天然活性，提高了检测的灵敏度和特异性。

MB@MOF载体的构建是通过将Zr-MOF纳米颗粒，使用1,1,2,2-四（4-羧基苯基）乙烷（TCPE）作为有机配体合成，固定在磁珠表面。这种载体不仅能够稳定且密集地负载SA，还能够维持其天然结构和活性，从而实现对anti-CCP抗体的高灵敏度检测。实验结果表明，该基于MB@MOF载体的CLIA方法在检测限和线性范围内均表现出优异的性能，检测限为0.1 RU/mL，线性范围为0.5–200 RU/mL。通过使用36份临床血清样本进行验证，结果显示该方法与标准临床分析仪的结果高度一致，整体诊断准确率为91.7%。该策略显著简化了检测流程，为类风湿性关节炎的高效、快速诊断提供了新的可能性。

类风湿性关节炎是一种自身免疫性的慢性炎症性关节疾病，影响全球约1800万人。延迟诊断和治疗可能导致关节畸形、功能障碍，甚至出现关节外表现，如心血管疾病、胃肠道疾病和神经系统受累。anti-CCP抗体因其高度特异性，已成为类风湿性关节炎早期诊断的重要标志物。尽管酶联免疫吸附测定（ELISA）因其高灵敏度、特异性和成本效益被广泛应用于临床，但其操作流程繁琐、易受操作者影响且动态范围受限，因此不太适合快速诊断。相比之下，CLIA因其更高的灵敏度和更广的动态范围，成为一种有前景的替代方法。

在CLIA中，核心步骤是将生物素化的CCP抗原偶联到SA修饰的磁珠上，以高效捕获anti-CCP抗体。然而，传统SA修饰磁珠的结合位点有限，且表面功能化过程需要耗时的化学偶联步骤，通常耗时超过3小时甚至需要过夜处理，这不仅增加了操作难度，还可能破坏SA的活性和天然结构，导致结合效率降低、灵敏度下降以及检测结果的不一致性。因此，为了提高CLIA在临床中的适用性，需要开发新的策略以增强磁珠的结合能力和功能化效率。

金属有机框架（metal-organic frameworks, MOFs）作为一种由金属离子和有机配体组成的晶状多孔材料，因其良好的生物相容性、超高比表面积、丰富的功能基团以及简便的合成方法，被认为是生物传感领域的理想材料。其中，基于锆的MOFs（Zr-MOFs）在生物医学应用中尤为突出，因其优异的化学和水稳定性、高比表面积以及出色的缺陷容忍性。更重要的是，Zr??离子具有较高的氧化态、电荷密度和键极化能力，能够与电子供体基团（如羧基、磷酸基或羟基）形成稳定的配位键，这使得Zr-MOFs在生物分子固定方面具有显著优势。近年来，研究显示Zr-MOFs可以通过物理化学吸附直接固定抗体，为构建检测探针提供了一种简单有效的方法。

在本研究中，我们设计了一种基于Zr-MOF纳米颗粒修饰的磁珠载体（MB@MOF），并利用其独特的结构和性质，实现了对SA的高效固定。MB@MOF的构建过程基于合理的表面电荷设计，通过分步处理磁珠表面，使其具备丰富的功能基团，从而增强与SA的结合能力。实验表明，该载体不仅具有高比表面积和均匀的粒径分布，还能够通过电荷相互作用和配位键形成稳定的SA固定，有效保留SA的天然活性。这种一步法的组装过程不仅简化了生物分子偶联的步骤，还避免了对化学试剂的依赖，显著提高了检测的效率和准确性。

通过系统的优化实验，我们对SA浓度、MB@MOF载体用量、生物素化CCP抗原浓度以及AP-anti-Ab体积等关键参数进行了评估，以确保检测方法的高灵敏度和高效性。实验结果显示，当SA浓度为100 μg/mL时，ΔCL信号最强，表明该浓度是最佳选择。同时，MB@MOF载体的最优用量为200 μg/mL，生物素化CCP抗原的最优浓度为0.167 μg/mL，AP-anti-Ab的最优体积为120 μL。这些优化结果表明，该基于MB@MOF载体的CLIA方法能够在短时间内实现对anti-CCP抗体的高效检测，具有广阔的应用前景。

为了评估该方法的分析性能，我们对其结合效率、抗干扰能力、灵敏度和检测限进行了系统研究。通过流式细胞术（flow cytometry, FCM）分析，发现MB@MOF载体能够显著提高SA的结合效率，其荧光强度达到140,000，远高于传统SA修饰磁珠的40,000。此外，实验结果显示，该方法在检测过程中对常见的干扰物质（如IL-6和CRP）表现出良好的抗干扰能力，仅anti-CCP抗体能够产生显著的CL信号。灵敏度评估显示，CL信号强度与anti-CCP抗体浓度呈线性关系，且检测限为0.1 RU/mL，表明该方法具有极高的灵敏度。

在临床适用性方面，我们收集了36份临床血清样本，其中包括19份anti-CCP阳性样本和17份anti-CCP阴性样本，以验证该方法的实际效果。通过与标准临床分析仪的对比，结果显示该基于MB@MOF载体的CLIA方法与临床方法的检测结果高度一致，整体诊断准确率为91.7%。ROC曲线分析进一步表明，该方法具有优异的诊断性能，其曲线下面积（AUC）为0.9752，灵敏度为89.5%，特异性为94.1%。此外，混淆矩阵分析显示，该方法仅出现两例假阴性和一例假阳性，进一步验证了其在临床中的可靠性。

本研究的成果表明，基于MB@MOF载体的CLIA方法在类风湿性关节炎的早期诊断中具有重要的应用价值。该方法不仅显著提高了检测的效率和灵敏度，还简化了操作流程，降低了对化学试剂和复杂条件的依赖。通过结合Zr-MOF纳米颗粒的高结合能力与磁珠的高比表面积，该载体在生物分子固定方面展现出独特的性能，为构建高效、便捷的免疫检测平台提供了新的思路。此外，Zr-MOF载体的丰富功能基团使其不仅适用于anti-CCP抗体的检测，还具有检测其他生物分子（如核酸和外泌体）的潜力，显示出在生物传感领域的广泛应用前景。

综上所述，本研究提出了一种基于Zr-MOF纳米颗粒修饰的磁珠载体（MB@MOF），通过一步物理化学吸附实现SA的高效固定，显著提高了CLIA方法的性能。该方法在检测限、线性范围、抗干扰能力以及临床适用性方面均表现出优异的特性，为类风湿性关节炎的早期诊断提供了一种快速、高效且可靠的检测手段。此外，该策略的简便性和高灵敏度也为其他免疫检测方法的开发提供了新的方向，有望在临床实践中发挥重要作用。