流体界面约束的split crRNA-Cas12a系统：一种用于快速、高灵敏miRNA检测的无扩增新方法

《Microchemical Journal》：Fluid interface-constrained split crRNA-Cas12a for rapid and high sensitive miRNA detection

本研究针对现有split crRNA-Cas12a系统检测miRNA灵敏度不足的问题，开发了基于脂质体流体界面约束的FISH-Cas12a新方法。通过将反应底物锚定于脂质体表面，利用界面限制效应增强分子碰撞效率，实现了0.42 pM的检测限，较分散系统提升一个数量级，为肿瘤早期诊断提供了新工具。

　　

在肿瘤的发生和发展过程中，循环microRNA（miRNA）扮演着关键角色，成为肿瘤诊断和预后评估中极具潜力的生物标志物。然而，由于miRNA在体液中含量极低，且传统检测方法往往需要复杂的预扩增步骤，容易引入污染和假阳性结果，因此开发一种快速、高灵敏且无需扩增的miRNA直接检测技术成为当务之急。

近年来，CRISPR-Cas系统在分子诊断领域展现出巨大潜力。其中，CRISPR/Cas12a（Cpf1）因其在特异性识别目标后能非特异性切割单链DNA（ssDNA）报告分子，被广泛应用于核酸检测。尽管已有研究利用split crRNA（成簇规律间隔短回文重复序列RNA）、split激活剂或完整crRNA系统实现miRNA的直接检测，但这些策略因激活效率或分子碰撞效率低，其灵敏度仍难以满足临床需求。此外，基于纳米颗粒或DNA纳米结构的局部反应平台虽能提高分子碰撞速率，但其静态特性限制了进一步的效果提升。

为解决上述问题，重庆医科大学医学检验学院刘建雄、李新敏、周丹丹等人开发了一种流体界面约束的split高性能crRNA-Cas12a（FISH-Cas12a）系统，用于miRNA的快速、高灵敏检测。该研究成果发表在《Microchemical Journal》上，为无扩增miRNA检测提供了新思路。

研究人员通过薄膜水合法合成脂质体，并利用动态光散射（DLS）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）对脂质体进行表征。随后，将胆固醇修饰的连接链ssDNA与支架RNA（scaffold RNA）杂交，并与脂质体、Cas12a蛋白及ssDNA报告分子共同组装成FISH-Cas12a系统。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证三元复合物的形成，并利用荧光强度测量和酶动力学分析评估系统性能。

3.1. FISH-Cas12a系统的原理

FISH-Cas12a系统通过将ssDNA报告分子和嵌合复合物锚定在脂质体表面构建而成。该复合物由连接链ssDNA与支架RNA杂交形成，其中连接链ssDNA既作为连接链，也作为CRISPR-Cas12a的激活剂。当存在目标miRNA时，其与连接链的5′端互补结合，完成crRNA结构，激活Cas12a的反式切割活性，进而切割脂质体表面的ssDNA报告分子，产生放大的荧光信号。

3.2. FISH-Cas12a的表征

透射电镜显示脂质体呈近球形，平均直径约为115.6纳米。zeta电位和动态光散射结果表明，核酸和Cas12a成功组装在脂质体表面。荧光实时监测显示，在目标miRNA存在下，FISH-Cas12a系统在90分钟内荧光信号逐渐增强，而分散的split Cas12a系统信号显著较低，证实了流体界面约束系统的优越性。

3.3. FISH-Cas12a的优化

通过优化支架RNA和连接链ssDNA的浓度、二者互补碱基数、反应温度、缓冲液类型和Mg²⁺浓度等条件，确定在37°C、1×NEBuffer 2.1（含10 mM Mg²⁺）下反应效果最佳。此外，互补碱基数越多，Cas12a的可及性和切割动力学越快。

3.4. FISH-Cas12a的性能

酶动力学分析显示，FISH-Cas12a的催化效率（k_cat/K_M为7.3×10⁵ M^-1s^-1）是分散系统的两倍。在优化条件下，系统对miRNA的检测限达0.42 pM，线性范围为5-500 pM，较分散系统灵敏度提高11倍。

3.5. FISH-Cas12a的特异性和重复性

系统对目标miRNA-21具有高度特异性，非互补序列（如miRNA-210、miR-let-7a）均未引发显著信号。单核苷酸多态性（SNP）分析表明，系统能有效区分单碱基突变。批内和批间重复性的相对标准偏差（RSD）分别低于2.4%和1.9%，显示系统具有良好的重现性。

3.6. 人血清中miRNA的检测

在加标人血清实验中，系统表现出高回收率（94.9%-106.4%）和低RSD（2.3%-5.6%），证明其在复杂生物样本中具有良好的适用性。

综上所述，FISH-Cas12a系统通过流体界面约束效应显著提高了分子碰撞效率和局部底物浓度，实现了miRNA的高灵敏、无扩增检测。该方法不仅避免了反转录带来的误差，还因使用DNA报告分子降低了成本。尽管目前仍无法直接检测亚飞摩尔（sub-fM）至阿托摩尔（aM）水平的miRNA，且多靶标检测能力有限，但本研究为miRNA分析提供了一种操作简便、灵敏度高、特异性强的检测新范式，在疾病早期诊断领域具有重要应用前景。